探讨白纹伊蚊唾液rAlb34k2蛋白对大肠杆菌的抑制及黏附作用.doc

探讨白纹伊蚊唾液rAlb34k2蛋白对大肠杆菌的抑制及黏附作用 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：探讨白纹伊蚊唾液rAlb34k2蛋白对大肠杆菌的抑制及黏附作用 1 1、材料与方法 2 2、结果 4 3、讨论 5 文2：远程氧等离子体对大肠杆菌的灭菌效果与机理研究 7 1　材料与方法 8 1．1 实验装置 8 1．2 实验方法 8 2　结果与讨论 10 2．1 远程氧等子体中活性物种的分布 10 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 12 正文 探讨白纹伊蚊唾液rAlb34k2蛋白对大肠杆菌的抑制及黏附作用 文1：探讨白纹伊蚊唾液rAlb34k2蛋白对大肠杆菌的抑制及黏附作用 蚊是一类重要的医学昆虫媒介，通过叮咬过程经蚊唾液向人类传播疾病。蚊唾液中不仅具有调控蚊虫吸食、吸血、传播蚊媒病原等功能的蛋白分子[1，2，3，4]，同时也包括多种免疫活性分子，如C型凝集素、肽聚糖识别蛋白、溶菌酶等，参与维护蚊自身的免疫防御功能[5，6，7，8]。由于蚊唾液蛋白在蚊免疫防御与其向宿主传病致病中的双重作用，使得发现并阐明新的蚊唾液蛋白的免疫活性功能至关重要。据推测蚊唾液腺可分泌上百种生物活性蛋白，且大多数功能不清[5]。埃及伊蚊和白纹伊蚊是传播登革病毒、寨卡病毒、基孔肯雅病毒等虫媒病毒的主要蚊媒，在我国白纹伊蚊分布广泛[9]。研究者在伊蚊属雌蚊唾液腺转录组中发现一组高表达、特异性的34k蛋白家族，并证实含有34k1和34k2两个分泌性蛋白成员[10，11，12]。生物信息学预测未发现该家族蛋白存在可寻的生物学活性[13]。本课题组前期通过原核重组表达获得了白纹伊蚊(广州株)唾液34k2蛋白(rAlb-34k2)，在本文中利用细菌结合实验探讨rAlb-34k2蛋白对大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的黏附效应，同时以重组表达的同源蚊唾液的C型凝集素蛋白(命名为:rAalb-CTL2)为对照，分析对大肠杆菌生长OD600值的影响，以期为发现白纹伊蚊唾液腺高表达的34k2蛋白的免疫生物活性提供实验依据。 1、材料与方法 材料 重组白纹伊蚊雌蚊唾液34k2蛋白[13](后文均简写为rAlb-34k2)、重组白纹伊蚊雌蚊唾液CTL2蛋白(后文均简写为rAalb-CTL2)，均为本实验室构建、表达、纯化并获得原核表达的可溶性蛋白。 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为本实验室常规培养保存;鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、乙型溶血性链球菌为贵州医科大学检验学院杨蕾老师提供。 兔抗rAlb-34k2多克隆抗体为本实验室制备，HRP标记的山羊抗兔IgG抗体购于Invitrogen公司，彩虹180kD广谱蛋白Marker购于北京Solarbio公司，ECL发光液购于美国Bio-Rad公司。DYX-DH隔水式电热恒温培养箱为上海跃进医疗器械厂产品，Epoch2型超微量微孔板紫外分光光度计购于美国BioTek公司，多功能成像分析系统购于美国Bio-Rad公司，6YY-6型电泳仪购于北京六一生物科技有限公司，3D漩涡混合仪购于常州朗越仪器制造有限公司。 方法 将各细菌菌种接种于LB固体培养基，37℃电热恒温培养箱中培养24h，次日挑取单克隆菌至LB液体培养基，37℃、200min气浴恒温振荡器培养16h，取对数生长期的细菌菌液用于后续实验。 -34k2蛋白与细菌结合情况 5000min离心5min，收集2ml菌液中的菌体，用500μlTBS缓冲液重悬菌体沉淀，加入500μlrAlb-34k2蛋白溶液(终浓度为200μg/ml)，阴性对照组加入500μlTBS缓冲液，于室温下3D旋转混合仪上孵育1h，5000min离心5min收集菌体沉淀后用TBS缓冲液洗涤5次，用200μl7%SDS溶液孵育菌体10min，离心收集最后的菌体沉淀和7%SDS上清液。将末次TBS洗脱液、7%SDS上清液及菌体沉淀作为样品进行SDS，转膜后利用兔抗rAlb-34k2蛋白多克隆抗体(5%脱脂奶粉稀释1∶8000)和HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(5%脱脂奶粉稀释1∶10000)进行Westernblot检测[14] -34k2蛋白对大肠杆菌生长的影响 将对数生长期的大肠杆菌(1μl/孔)和10×LB液体培养基(10μl/孔)加入96孔板，再按下述分组进行加样:①rAlb-34k2蛋白组:在细菌悬液中加入终浓度分别为137、112、96、64、48、32、16ng/μl的rAlb-34k2蛋白溶液;②含Ca2+的rAlb-34k2蛋白组:在①组的基础上各孔加入终浓度为30mmol/L的CaCl2溶液;③rAalb-CT