化学仪器分析小结.pdfVIP

-- 高效液相色谱分析法 一、高效液相色谱仪的结构与功能组成 高效液相色谱仪主要有进样系统、输液系统、分离系统、检测系统和数据处理系统，下面将 分别叙述其各自的组成与特点。 1．进样系统 一般采用隔膜注射进样器或高压进样间完成进样操作，进样量是恒定的。这对提高分析样品 的重复性是有益的。 2．输液系统 该系统包括高压泵、流动相贮存器和梯度仪三部分。高压泵的一般压强为l．47～4．4X107Pa， 流速可调且稳定，当高压流动相通过层析柱时，可降低样品在柱中的扩散效应，可加快其在 柱中的移动速度，这对提高分辨率、回收样品、保持样品的生物活性等都是有利的。流动相 贮存错和梯度仪，可使流动相随固定相和样品的性质而改变，包括改变洗脱液的极性、离子 强度、PH值，或改用竞争性抑制剂或变性剂等。这就可使各种物质（即使仅有一个基团的 差别或是同分异构体）都能获得有效分离。 3.分离系统 该系统包括色谱柱、连接管和恒温器等。色谱柱一般长度为10～50cm （需要两根连用时， 可在二者之间加一连接管），内径为2～5mm，由优质不锈钢或厚壁玻璃管或钛合金等材料 制成，住内装有直径为5～10μm粒度的固定相（由基质和固定液构成）．固定相中的基质是 由机械强度高的树脂或硅胶构成，它们都有惰性（如硅胶表面的硅酸基因基本已除去）、多 孔性（孔径可达1000?）和比表面积大的特点，加之其表面经过机械涂渍（与气相色谱中固 定相的制备一样），或者用化学法偶联各种基因（如磷酸基、季胺基、羟甲基、苯基、氨基 或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类固定相对结构不同的物质有良 好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中 的一种糖蛋白分离出来。 另外，固定相基质粒小，柱床极易达到均匀、致密状态，极易降低涡流扩散效应。基质粒度 小，微孔浅，样品在微孔区内传质短。这些对缩小谱带宽度、提高分辨率是有益的。根据柱 效理论分析，基质粒度小，塔板理论数N 就越大。这也进一步证明基质粒度小，会提高分 辨率的道理。 再者，高效液相色谱的恒温器可使温度从室温调到60C，通过改善传质速度，缩短分析时间， 就可增加层析柱的效率。 -- 4．检测系统 高效液相色谱常用的检测器有紫外检测器、示差折光检测器和荧光检测器三种。 （1）紫外检测器 该检测器适用于对紫外光（或可见光）有吸收性能样品的检测。其特点：使用面广（如蛋白 -10 质、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；灵敏度高（检测下限为10 g/ml）； 线性范围宽；对温度和流速变化不敏感；可检测梯度溶液洗脱的样品。 （2）示差折光检测器 凡具有与流动相折光率不同的样品组分，均可使用示差折光检测器检测。目前，糖类化合物 的检测大多使用此检测系统。这一系统通用性强、操作简单，但灵敏度低（检测下限为 10-7g/ml），流动相的变化会引起折光率的变化，因此，它既不适用于痕量分析，也不适用 于梯度洗脱样品的检测。 （3）荧光检测器 凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比。因此，这一 检测器只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质 等）的测定，其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g/ml），痕量分析和梯度洗脱作品的检 测均可采用。 （5）数据处理系统 该系统可对测试数据进行采集、贮存、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴 定工作能正确开展。 二、液相色谱柱的正确安装和使用说明 液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色谱柱的正确安装 和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的必经之路。 （一） 液相色谱柱的安装： 1、液相色谱柱的结构： a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。 柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸外螺纹，另一端 是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接， 中间放置压坏用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接，中间也放 置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少