工程菌构建载体介绍.pptxVIP

第二篇 基因工程;第三章 载体;1. 载体 （Vectors）：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。 2. 载体的种类（基因工程中常用的载体有5类：） 质粒（plasmid） 、单链DNA噬菌体M13、?噬菌体的衍生物 、柯斯质粒（cosmid）动物病毒（virus） ;3.基因工程对载体的要求 （1）在宿主细胞内能独立复制。 （2）有选择性标记。 （3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复制。 （4）分子量小，拷贝数多。 （5）容易从宿主细胞中分离纯化。;第一节 质粒载体;1. 质粒的一般生物学特性 （1）分子小：1—200 kb （2）环形状：双链环状DNA。 （3）质粒的空间构型： ① 共价闭合环状DNA（cccDNA)呈超螺旋（SC）（super coil） ② 开环DNA（ open circular， ocDNA）一条链上有一至数个缺口。 ③ 线形DNA （ linear ，lDNA） （4）质粒空间构型与电泳速率 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：scDNA最快、l DNA次之、ocDNA最慢。;二、质粒的复制类型;三、质粒载体的构建;2. 质粒载体必须具备的基本条件;3. 质粒的选择标记及其工作原理：;（2）抗菌素选择原理 不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选择培养基）中生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长。;4. 人工构建的质粒载体的类型;（2）低拷贝数的质粒载体 由pSC101派生来的载体特点是分子量小，拷贝数低。pLG338、pLG339、pHSG415等，不适合大量扩增DNA用。 但有特殊用途:当有些被克隆的基因的表达产物过多时会严重地影响寄主菌的正常代谢活动，导致寄主菌死亡时，就需要低拷贝的载体。;（3）失控的质粒载体 这是一类温度敏感型复制控制质粒。1979年B. E. Uhlin等构建。 如pBEU1、pBEU2。温度低（低于37 ℃ ），拷贝数很少； 温度增加（40 ℃）时，拷贝数会很快增加到1000个以上。 （4） 插入失活型质粒载体 载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329。;（5） 表达型质粒载体 主要用来使外源基因表达出蛋白质产物。注意启动子的性质，终止子、起始密码、终止密码的阅读正确。如果在大肠??菌里表达，必须把所克隆的真核生物的基因置于大肠杆菌的转录—翻译信号控制之下。 ① 表达载体的结构 1）强启动子，一个可诱导的强启动子可以使外源基因高效地转录 2）在启动子下游和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD），促进蛋白质的翻译。 3）在外源基因插入的序列下游有一个强转录终止子，保证外源基因的有效转录和mRNA 的稳定性。 ;五、经典的大肠杆菌质粒载体;2. pBR322：;（4）克隆位点：其中9个会导致Tetr基因失活（如BamH I、Hind Ⅲ、Sal I）； 3个会导致Ampr基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。24个克隆位点。 ;;（5）pBR322的优点;② 分子小，克隆能力大 载体越小越好。 10kb的DNA在纯化过程中容易断裂。 ③ 高拷贝数：氯霉素扩增之后，每个细胞可达1000~3000copy ④ 安全：失去了转移蛋白基因mob（mobilization）。不能通过接合转移。 ;3. pUC系列;;;（4）选择标记：Ampicillin 抗性和 lacZ的?肽互补（蓝白斑）相结合。 蓝白斑选择原理： ① Xgal ② ?-半乳糖苷酶Xgal显色反应：?-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝。 ③ lacZ的?肽互补;1）?-肽（ lacZ’ ）： ?-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸）（不完整的肽链）。lacZ只有在4聚体的状态下才有功能。 2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15） 受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失?肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xgal。 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a;3）载体lacZ’与?互补 pUC质粒载体上的lacZ’ 编码?肽与这个缺失突变的?-半乳糖苷酶“互补”，使它能形成4聚体。又能分解Xgal。产生蓝色物质。;pUC载体上LacZ’的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补