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家畜布鲁氏菌病血清学平板试验（PAT） 一、应备有下列材料： 受检血清：受检血清必须新鲜,无溶血现象、腐败现象、气味。 在实验前血清必须置于温室中，使其达到 20℃左右。 抗原：由兽医生物药品厂生产供应。本抗原由加热杀死的布鲁氏菌菌体经染色制备而成的淡蓝色悬浮液。抗原本身出现凝集者应废弃。使用前应充分振荡，并使其温度达到 20℃左右。 阴、阳性血清：由兽医生物药品厂生产供应，本方法所用的阴、阳性血清与试管凝集试验法相同。 二、 操作方法： 备一方形洁净的玻璃板：划成 25 个方格，横数 5 格，纵数 5 格， 每格四平方公分，第一列各格写下血清号码。 用 0.2 毫升灭菌吸管按下列剂量加受检血清于任何一行（横格）的各格中：第一格 0.08 毫升，第二格 0.04 毫升，第三格 0.02 毫升，第四格 0.01 毫升。（如下表） 血清号 第一格 第二格 第三格 第四格血清量 （毫升） 1 0.08 0.04 0.02 0.01 2 0.08 0.04 0.02 0.01 3 0.08 0.04 0.02 0.01 4 0.08 0.04 0.02 0.01 由于本试验所需血清量较少，因此，在操作过程中要求严格，应尽可能减少误差，最好滴出血清前用滤纸片擦去吸管表面沾附的血清。 3.加平板反应抗原原液 0.03 毫升于上述各血清量中，并用牙签或细铁丝混匀，使抗原和血清推开，面积直径约 2—3 公分的圆形。由血清量最少的一格（即第四格）混起，每份血清用一根牙签，用过的牙签要放固定容器中，工作完毕后集中烧毁。若用细铁丝作混合，每份血清混匀后应用酒精棉花擦净，然后再作另一份血清的混合。 混合完毕，将玻璃板置于酒精灯火焰或凝集反应箱上，均匀加温， 使达到 30℃左右，并轻轻摇动玻板，使血清与抗原混合液呈缓慢的旋转运动，以保证充分混合。5—8 分钟内记录反应结果。 每次试验用 1—2 份已知阴性血清和 1—2 份阳性血清作平板凝集反应，以资对照。 按下列标准用加号记录反应强度 “＃”出现大的凝集片或小的颗粒物，液体完全透明，即 100%凝集。“+++”有明显的凝集片，液体几乎全部透明，即 75%凝集。 “++”有可见的凝集片，液体不甚透明，即 50%凝集。“+”液体混浊，有仅仅可以看出的粒状物，即 25%凝集。“—”液体均匀混浊。 平板凝集反应与试管凝集反应的关系：用兽医生物药品厂生产的平板抗原作平板凝集试验时，0.08 毫升血清的反应相当于试管法中 1： 25 血清稀释液的反应，0.04 毫升的反应相当于 1：50，0.02 毫升的反应相当于 1：100，0.01 毫升的反应相当于 1：200。 三、 结果判定 在我国，牛、马和骆驼于 0.02 毫升的血清量，猪、山羊、绵羊和狗 于 0.04 毫升的血清量，出现两个加号以上凝集现象时，被检血清判为阳性反应。 牛、马和骆驼于 0.04 毫升血清量,猪、山羊、绵羊和狗于0.08 毫升的血清量，出现两个加号以上凝集现象时，被检血清判为可疑反应。 可疑反应的牲畜，经 3—4 周，须重新采血检验。牛和羊，如果重检时仍为可疑，可以判定为阳性，猪和马重检时，如果凝集价仍然保持可疑反应水平，而农场中的牲畜没有布病临床症状和没有大批阳性反应的患畜出现，该畜血清判定为阴性。 附：虎红平板凝集试验（RBPT） 虎红平板试验的特点 布鲁氏菌虎红抗原是酸性和具有缓冲作用的染色抗原，虎红平板试验能揭露猪、牛、羊、鹿布鲁氏菌病患病机体血清中的特异性IgG1 亚类抗体。但也有人提出对IgG2 和IgM 抗体敏感性较高，椐国外资料报导，该试验与常规试管凝集反应试验相比，能较早地检出患病动物， 目前为止，国内和国外的资料证明，虎红平板试验与补体结合试验结果较为接近。该试验操作简便，不需要复杂的设备，并且能迅速获得结果，适用于田间试验和筛选诊断之用。虎红平板试验判定方便，具有阳性结果的样品须进一步作补体结合试验或其它辅助试验。这样做既可节省劳力又可节省时间和得出较为正确的诊断结果。 在进行虎红平板试验前，应将抗原和受检血清放置室温 30—60 分 钟。准备一块洁净的玻璃板，用蜡笔划成四平方厘米的方格，每格中滴一份受检血清 0.03 毫升。吸取抗原（抗原在吸取前应反复倒转抗原瓶并摇动，使抗原均匀悬浮）。在每一方格的血清样品旁滴 0.03 毫升，每份血清用一根牙签搅动使血清和抗原均匀混合，使抗原和血清摊开成呈圆形直径约 2—3 厘米。于 4 分钟内判定结果。出现凝集现象就判为阳性反应，否则判为阴性。 吸取抗原和血清最好采用 0.2 毫升吸管，或选择每滴正好 0.03 毫升的毛细滴管。如果吸管数量有限,用过的吸管应至少连续通过三个盛有生理盐水的杯子冲洗。 虎红抗原应置于 4—15℃冰箱中或冷暗处保存，不可结冻，从生产日期起有效期为一年