《色谱分析》教学课件—04高效液相色谱法.pptVIP

硅胶 无定形全多孔硅胶 （YWG） 球形全多孔硅胶 （ YQG） 固定相分类 常用固定相 固定相特点 高分子微球 化学键合相 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定。载样量大；适于梯度洗脱 色谱柱-固定相 非极性键合相（ODS ） 中等极性键合相（醚基键合相） 极性键合相（氨基、氰基键合相） 柱选择性好， 峰形好， 柱效低 多孔微球（YSG ） 色谱柱使用 使用前 使用后 若所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用低浓度甲醇-水，再用甲醇冲洗。 仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等； 使用保护柱 使用时 若色谱柱不使用时,应用甲醇冲洗,取下后紧密封闭两端保存。 色谱柱-使用注意事项 在使用新柱之前，最好用强溶剂在低流量下（0.2-0.3ml/min)冲洗30min，长时间未用的分析柱也要同样方法处理。 注意轻拿轻放，注意色谱柱方向，箭头左端接进样器再连接保护柱， 右端连接检测器。基线平稳后，进样。 4.1 高效液相色谱仪 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 检测系统的主要部件是检测器（detector）。检测器的作用是将色谱柱分离出组分的量或浓度定量转化为可供检测的电信号。检测器按其检测方式分为浓度型和质量型两种。按其适用范围检测器又可分为通用型和专用型两大类。 检测器 通用性 专用型 示差折光检测器 蒸发光散射检测器 紫外检测器 光电二极管阵列检测器 荧光检测器 样品组分在蒸发室内形成气溶胶，然后进入检测室。用强光或激光照射气溶胶而产生光散射，测定散射光强而获得组分的浓度信号。 根据物质的折光率不同 紫外检测器 类型 工作原理 特点 应用范围 光电二极管阵列（DAD） 蒸发光散射 检测器（ELSD) 示差折光 检测器 基于被分析组分对特定 波长紫外光的选择性吸收 定量基础： 朗伯-比耳定律A=ECl 荧光检测器 灵敏度低；检测10-1 (g/ml) ，不能梯度洗脱 检测所有物质 灵敏度高（10-10） 检测有紫外吸收的物质 同紫外检测器 灵敏度高（10-10）；可以获得三维光谱-色谱图。 检测有紫外吸收的物质 荧光强度与荧光物质的 浓度成正比。 F=KC 灵敏度高（10-12） 检测能产生荧光的物质 可检测所有物质；不适合微量分析；对温度变化敏感。 灵敏度与载气流速、 汽化室温度和激光 光源强度等参数有关 高效液相色谱中各检测器的组成及应用 光电二极管阵列检测器（photodiode array detector，PADA），由多个光电二极管阵列组成，瞬间实现物质在紫外区域的全波段扫描，获得物质光谱特征的三维色谱图。 从获得的三维数据中可以提取出各个色谱峰光谱图，并找出最大吸收波长，利用色谱保留值及光谱特征进行定性分析；根据色谱图进行定量分析。 图4-5 HPLC的三维光谱-色谱图 通用型 － 比流动相挥发性小的物质都能被检测。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。 但对挥发性化合物的检测不理想。 可以使用有强紫外吸收的溶剂作流动相。不能使用不挥发性的流动相（例如：磷酸盐） 与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高。可梯度洗脱。 图4-6 ELSD检测器示意图 输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 数据处理系统 4.1 高效液相色谱仪 目前，HPLC的数据处理系统是应用计算机和相应的色谱软件或色谱工作站，对样品进行采集、处理和分析数据，通过自动积分仪，自动计算峰面积，自动记录峰的保留时间，自动打印分析报告。 4.2 HPLC分析条件的选择 4.2.1HPLC法的速率理论 高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上，引入了气相色谱的理论和技术发展而成的现代液相色谱分析方法。因此，气相色谱法中介绍的基本概念、塔板理论及速率理论，都适用于高效液相色谱法。 但高效液相色谱法与气相色谱法的主要差别是流动相的性质不同。因此，速率理论的表现形式有某些差别。 T↓；η粘度↑； u↑→ 忽略B/u 填充柱 H = A + B/u + Cu H = A + Cu 范氏方程H = A + B/u + Cu GC HPLC 毛细管柱 H = B/u + Cu B/u 忽略原因 图4-8GC 和 HPLC 的 H-u 图 H = B/u + Cu H = A + Cu GC