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细胞凋亡的检测方法综述-2 方法三（1）收集细胞悬液（106细胞），低速离心（1000r/min，离心5min）。（2）去上清，沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。（3）13 000r/min，离心10min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加等量50％异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀，置液氮5min。（4）12 000r/min，离心10min，弃上清，沉淀真空抽干。（5）加TE 100μl，65℃加热10min，取20μl，加1～2μl上样缓冲液，电泳观察。方法四（1）收集细胞，1000r/min离心5min，去上清。（2）用冰预冷的70％乙醇固定，可长期保存于－20℃冰箱。（3）1000r/min离心5min，去除固定液，用约0.5ml的PBS重悬细胞。（4）转入Eppendorf管中，同法离心，去上清。（5）细胞用40μl PC缓冲液重悬，室温30～60min。（6）1000r/min离心5min，吸上清于新的Eppendorf管中，真空浓缩15min。（7）加入0.25％ NP-40溶液3μl，1mg/ml RNase A溶液3μl，37℃，30min。（8）加入3μl蛋白酶K，37℃，30min。（9）加入12μl样品稀释液，含溴化乙锭的1.5％琼脂糖电泳，观察2、琼脂糖凝胶电泳的定量检测方法一：简易末端标记法（1）按常规提取细胞DNA。（2）在0.5ml的EP管中加入细胞DNA，反应体系如下：细胞DNA 0.5～1.0μg，10×缓冲液2μl，32P-dATP（或-dCTP）0.5μCi，Klenow聚合酶5U，双蒸水加至20μl。（3）混匀后稍加离心，室温反应30min。（4）加1μl 0.5mol EDTA终止反应。（5）常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，真空抽干。（6）溶于20μl的TE缓冲液中。（7）取标记DNA在1.8％琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。（8）电泳后的凝集置滤纸上烘干，进行放射自显影。方法二：5’末端32P标记法细胞DNA的提取（1）细胞悬液离心后，沉淀加消化缓冲液0.5ml，50℃ 3～5h，或37℃过夜。（2）用等体积的酚：氯仿：异戊醇抽提细胞裂解液。（3）将水相转移至新的试管，加入150mmol/L乙酸钠和10mmol/L氯化镁。（4）加入2倍体积的预冷无水乙醇，置液氮5min或－20℃ 12h。（5）12 000r/min离心沉淀DNA，70％乙醇洗1次后，真空抽干。（6）溶于20μl的TE缓冲液中。（7）加入终浓度为10μg/ml RNase，37℃，30min。（8）同法用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。（9）溶液20μl的TE缓冲液中，－20℃保存备用。DNA含量测定：用260nm波长紫外分光光度计：吸光单位为20时约为1mg/ml DNA。3、DNA 5’末端脱磷酸（1）取纯化的细胞DNA 10μg，然后加入：10×CIP 2μl（1U），双蒸水加至50μl。（2）37℃水浴2h。（3）90℃水浴5min以灭活CIP。（4）用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。