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PCR实验注意事项 实验中的一些好习惯加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性一定要记着关水浴箱，切记切记多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2. 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3. 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。因为DEPc不加选择的修饰蛋白质和RNA，因此在分离和纯化RNA过程中不能使用，而且它与一些缓冲液(例如Tri)不能相容在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。研究人员造成的污染 RNA酶最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此进行RNA实验时应勤换手套。但DEPC能与胺和巯基反应,因而 含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理（一）动植物总RNA提取-Trizol法 　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。 RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A) 分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。　　1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。 　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。  （6） 4℃离心，10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。（7） 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。（8） 抽提出的细胞总RNA干燥后加水50ul，取10ul加无Rnase水990ul，稀释100倍成1ml。于0.5cm厚的石英比色杯中，以无Rnase水为对照，在721型紫外分光光度计下检测，结果应为：A260/280 ratio<1.6。（9） 分离组织10mg（纯组织）加800ul Trizol试剂。（10） 扩增产物的鉴定DEPC处理方法如下：1. DEPC处理（1）DEPC水：100ml超纯水加入0.2ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip头；EP管和PCR反应管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。2. 提取 如何消除污染机器运行完后，取出PCR产物时不能随便丢弃，应该用塑料手套或其他打结包好后丢入垃圾桶。（1） 试剂：mixer尽量分装，不要原瓶多次取用。（2）加样：原则是DNA最后加，其他