DB37∕T 4436-2021 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程.docx

ICS 11.220 CCS B 41 37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4436—2021 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病 毒联合净化技术规程 Technical regulations for elimination of avian leukosis virus and reticuloendotheliosis virus 2021-11-17发布 2021-12-17实施 DB37/T 4436—2021 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 I DB37/T 4436—2021 禽白血病病毒与禽网状内皮组织增殖病病毒联合净化技术规程 1 范围 本文件规定了禽白血病病毒和禽网状内皮组织增殖病病毒的实验室检测技术要求和联合净化程序。 实验室检测包括抗原的ELISA检测、RT-PCR检测和病毒分离鉴定。 本文件适用于原种鸡群、祖代鸡群和父母代种鸡群的净化。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 禽白血病病毒与禽网状内皮增殖病病毒实验室检测技术 4.1 器材 高温高压灭菌锅 (温度范围：105℃～134℃；额定压力：0.23Mpa)、离心机（转速：2000rpm～ 14000rpm）、PCR仪、二氧化碳恒温细胞培养箱、分光光度计、酶标仪、冰箱。 4.2 材料与试剂 4.2.1 4.2.2 无RNase水。 商品化的ALV与REVELISA抗原检测试剂盒。ALV和REVELISA抗原检测试剂盒均通过检测泄殖 腔拭子，分别检测ALV所有亚群共有的抗原p27蛋白，或REV的主要免疫原性蛋白p30，从而对ALV和 REV的感染情况进行判定。 4.2.3 4.2.4 商品化的RNA提取试剂盒。 商品化的RNA反转录试剂盒。 4.2.5 PBS缓冲液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.42g（Na2HPO4·12H2O 3.58g），KH2P04 0.27g 溶于蒸馏水，定容为1000mL，过滤后高温高压灭菌备用。 4.2.6 细胞生长培养基：商品化的DMEM液，加10%胎牛血清，青霉素、链霉素各250IU/mL，储存于 4℃冰箱备用。 4.2.7 细胞维持培养基：配制方法同4.2.6，使用胎牛血清浓度为1%。 4.2.8 ALV-A gp85、ALV-B gp85、ALV-J gp85及 REV gp90基因片段的特异性引物，具体引物序列见 附录A。 4.2.9 除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T 6682的要求。 1 DB37/T 4436—2021 4.3 样品 4.3.1 血液样品：母鸡翅下静脉抽取1mL静脉血，制备血清；公鸡抽取1mL静脉血，2000rpm离心， 制备血浆，储存于-20℃冰箱备用。 4.3.2泄殖腔棉拭子样品：用无菌棉签插入泄殖腔内，擦拭后将棉签放入装有1mLPBS缓冲液的离心 管内，12000rpm离心 2min后将上清等分为 2份，将进行抗原检测的样品储存于-20℃冰箱备用，将 进行病毒分离及RNA提取的样品储存于-80℃冰箱备用。检测样品前，棉拭子应反复冻融2次～3次，4℃， 12000rpm离心2min～3min，吸取上清。血清样品于室温融化，500倍稀释，用于检测。 4.3.3 蛋清样品：将蛋壳灭菌后，用镊子将种蛋钝端敲破，使用移液器从破壳处沿蛋壳内壁伸入蛋内 约1cm，吸取1mL蛋清，并储存于-20℃冰箱备用。 4.4 病毒抗原的ELISA检测 4.4.1 操作方法：采用商品化的ELISA试剂盒检测泄殖腔棉拭子或蛋清。按照试剂盒提供的检测步骤 操作。 4.4.2 结果判定：按试剂盒提供的算法判定。ALV-p27和 REV-p30抗原其中之一为阳性，淘汰来源雏 鸡。如两者均可疑或其中之一为可疑，则需进行RT-PCR检测或病毒分离。 4.5 RT-PCR检测 4.5.1 操作方法 4.5.1.1 RNA及cDNA提取：将冻存于液氮罐内的棉拭子PBS溶液用商品化试剂盒提取RNA，用分光光 度计测浓度后，用商品化试剂盒反转录成cDNA。RNA储存于-80℃冰箱，cDNA储存于-20℃冰箱。 4.5.1.2 PCR及电泳检测：完成RNA提取和将RNA反转录成cDNA后，以cDNA为模板，利用ALV-Agp85、 ALV-B gp85、ALV-J gp85及RE