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用于多重重组凝血因子生产的工程CRISPR/Cas9抽象 目前的止血剂是从来自多个供体的合并血浆中获得的，需要昂贵的病原体筛查和处理。基于重组DNA的生产代表了一种工程解 决方案，可以改善供应，均匀性和平安性。目前的方法通常用于单基因候选肽，并且通常采用非人类细胞。我们设计了一种方 法，其中可以从单个细胞群中产生多个基因产物。我们从CRISPR/Cas9系统中鉴定出基因特异性协同激活介导（SAM）,用 于凝血因子II, VII, IX, X和纤维蛋白原的靶向过表达。CRISPR-SAM系统的组分在人胚胎肾细胞（HEK293）中表达，通过 定量RT-PCR （qRT-PCR）和ELISA分析评估单（单重）或多基因（多重）上调。因子II, VII, IX和X单重和多重活化导致 基因表达分别增加120-4700倍和60-680倍。纤维蛋白原亚单位基因激活导致单重或多重方法分别增加1700-92, 000倍和 80-5500倍。ELISA分析显示，候选基因产物伴有上调。我们的研究结果证明了 CRISPR / Cas9 SAM在人类细胞中单药或多 药生产的能力，并代表了增强当前重组肽生产技术的工程进步。 关键字:CRISPR;重组蛋白;凝血;多路复用;纤维蛋白原.引言 由遗传性疾病（例如血友病）、创伤、手术和抗凝治疗引起的出血可能需要止血凝血产品。新鲜冰冻血浆（FFP）、冷 沉淀物（CRYO）、纤维蛋白原浓缩物（FC）和凝血酶原复合浓缩物（PCC）是实现/维持止血的常用药物。目前: 从多 个不相关的供体汇集的血浆是凝固蛋白的来源，使它们受到供应链短缺和昂贵的病原体筛查的影响。缺乏容易获得、负担得起 且平安的凝血治疗产品来源是复苏医学领域的一个重大差距。 基于重组DNA （rDNA）的止血剂生产代表了一项工程进步，其基础是在体外将候选基因引入细胞中以进行超验基因表达 和蛋白质生产。哺乳动物细胞是这一过程的理想之选，因为大多数蛋白质都以物种特异性方式糖基化。因此，在非人类细胞中 产生的人类蛋白质获得与人类细胞沉积的糖基化模式不同的糖基化模式。蛋白质的糖基化谱是区分自我和非自我的重要免疫识 别机制。因此，非人生产的蛋白质可能具有高免疫原性，并且在可能连续给药的复苏产物的情况下，可引起同种异体抑制［1］。 人胚胎肾（HEK293）细胞系已被证明是一种能够产生重组凝血因子VIII、IX和纤维蛋白原的有效平台［2, 3］。根据定义, 重组技术采用编码候选基因的DNA,由细胞引入和产生。通常这些基因在质粒上出生，质粒是一种小的环状DNA物种，可以 高浓度和高纯度别离，并且在递送到细胞时，促进候选基因的超正发基因表达。最近，Popovic等人生产了纤维蛋白原的三个亚 基，评估了表达重组纤维蛋白原蛋白的单质粒和三质粒方法［3］。使用这种方法，他们证明了重组纤维蛋白原在HEK293细胞中 的过表达。其他人己经在非人类哺乳动物细胞系统中使用了类似的基于质粒的方法［4］。为了扩展这些研究，我们设计并优化了 一种转录组调制方法，采用簇状规那么间隔短回文重复序列（CRISPR） /Cas9系统。CRISPR/Cas9是一种可编程的DNA结合 蛋白，其中Cas9使用称为引导RNA （gRNA）的小RNA转录本定向到用户定义的基因组靶位点［5］。gRNA含有约15-20-bp 序列，该序列对应于基因组中的靶DNA序列，并通过Watson-Crick碱基配对结合。约80个核甘酸支架序列也存在于gRNA 中，并由Cas9结合形成功能复合物［5］。gRNA和Cas9都适合修饰，以实现增强的特性，如基因组、表观基因组和转录组编辑 ［5, 6］?我们假设Cas9的可编程性和工程宽容性将使凝血因子基因的转录上调成为可能，这代表了一种治疗性肽生产的新方法。 我们的研究设计基于从CRISPR/Cas9系统生成基因靶向试剂，以特异性上调凝血因子II, VII, IX, X和纤维蛋白原基因。为 了实现这一目标，我们采用了来自化脓性链球菌的催化无活性Cas9 （dCas9）,该链球菌融合到促进基因转录的病毒颗粒64 （VP64）转录激活结构域。dCas9-VP64的转录效力可以通过由热休克因子1 （HSF1）和核因子NF-kappa-B p65亚基（p65） 组成的协同活化模块（SAM）增强（图1A）⑹。为了实现这一点，将支架序列掺入到RNA结合适配子的gRNA中［6］。适配体 是一种短的单链DNA或RNA物种，可以选择性地结合特定的靶标，如蛋白质或肽。我们定义了 HEK293细胞中PCC （因子II, VII, IX和X）和纤维蛋白原的单个或多个过表达的最正确SAM序列。我们的研究结果代表了一种在人类细胞中产生用户定义的 重组肽混合物的有前途的方法。这种细胞产品代表了治疗肽的战略储藏，减