植物基因工程载体及其构建.pptVIP

精选ppt 2. T-DNA的整合机理 Mayerhofer等从转化的拟南芥菜中分离并测定插入的T-DNA及插入位点序列，发现T-DNA的插入使得靶序列缺失29～73bp。一部分整合的T-DNA片段不完整，两端均有缺失。靶序列断裂处与插入的T-DNA两端有部分重叠。另一部分整合的T-DNA却保持完整。其中一些插入的T-DNA能精确地取代植物靶序列，其右边界与靶序列连接，T-DNA左未端和靶序列裂口同源。还有一种情形则是，T-DNA插入片段的未端与缺失的靶序列裂口处并无同源性，而是在其内部有部分短片段与T-DNA未端同源。在靶序列裂口处还发现有DNA序列的倒位或重复。 T-DNA的整合是异常重组（illegitimate recombination ）的结果。T-DNA右未端在靶序列的识别及连接中是必需的，T-DNA左未端和两个靶DNA未端则参与部分配对和DNA修复。 3. T-DNA整合的遗传效应 T-DNA插入的位点不同，可使转基因植物具有不同的表型和遗传特性，即所谓位点效应（position effect）。已知T-DNA可插入多个物理位点。遗传位点数一般少于或等于插入的物理位点数，这是因为甲基化可使基因不表达，或者几个拷贝连锁在一起。多拷贝的T-DNA可插入不同的独立位点，或可首尾串联（trandem）插入同一位点，多拷贝T-DNA进人同一植物细胞后，这些拷贝之间可能相互作用，导致基因的沉默，这种现象现被称为共抑制（co-supression）。 T-DNA插入的遗传特性： (1)T-DNA的插入不引起植物DNA大的重排。但多数插入会导致靶位点处小的缺失，缺失多至79个核苷酸。 (2)另一个常见的结果是，在T-DNA／植物DNA连接处，会有几个至33个核苷酸的“填充”DNA（Filler DNA）存在，这些“填充”DNA的序列与靠近连接处的植物DNA序列相似。 (3)在植物靶位处不要求有特异的序列，但若在T-DNA两端和植物靶位处之间有一段短序列（5～10b）同源，则可以在整合中起作用。 六、农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控 目前已发现位于细菌染色体上的一些基因也和T-DNA的转移有关，并且已经了解它们编码的蛋白质的功能。ChvA、ChvB、ChvC参与细菌的附着功能；Cel位点与细菌表面纤维丝的合成有关;Att基因影响农杆菌细胞表面蛋白的合成；ivr基因的突变能使农杆菌细胞表面的脂多糖发生改变而影响农杆菌宿主范围；PscA和ExoC基因与多糖合成有关，并影响农杆菌附着能力。以上这些基因的突变将使细菌表面成分发生变化，从而丧失与植物细胞识别和结合的能力。此外，ChvD位点影响AS对毒性区的诱导效率和农杆菌的致瘤能力。CbvE位点编码一个单糖结合蛋白，与单糖影响Vir区的表达有关。Ros基因与Vir基因的负调节有关。可见，目前已知农杆菌染色体上有10个基因与T-DNA转移有关。 第四节 农杆菌Ti质粒的改造及载体构建 一、Ti质粒的改造及卸甲载体构建 二、中间载体的构建 三、中间表达载体的构建 四、植物基因转化载体系统的构建 一、Ti质粒的改造及卸甲载体构建 野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体，存在如下障碍：①Ti质粒分子量过大，一般在160～240kb，比pBR322质粒大50倍左右，在基因工程中难以操作；②大型的野生Ti质粒上分布着各种限制酶的多个切点，不论用何种限制酶切割，都会被切成很多片段，因此难以找到可利用的单一限制性内切酶位点，不能通过体外DNA重组技术直接向野生型Ti质粒导入外源基因；③T-DNA区内含有许多编码基因，其中Onc基因的产物干扰宿主植物中内源激素的平衡，转化细胞长成肿瘤，阻碍细胞的分化和植株的再生；④Ti质粒不能在大肠杆菌中复制, 即使得到重组质粒，也只能在农杆菌中进行扩增；而农杆菌的转化率极低（10％左右）,因此，通过Ti质粒的体外操作，在常规分子克隆条件下几乎不能构建在T-DNA中只有单一切点的载体；⑤Ti质粒上还存在一些对于T-DNA转移不起任何作用的基因。 为了使Ti质粒成为有效的外源基因导入载体，必须对野生型Ti质粒进行一番科学的改造。十分幸运的是，大肠杆菌具有能与农杆菌高效地接合转移的特性。因此，科学家们可以先将T-DNA片段克隆到大肠杆菌的质粒中，并插入外源基因，最后通过接合转移把外源基因引入到农杆茵的Ti质粒上，这是一种把预先进行亚克隆、切除、插入或置换的T-DNA引入Ti质粒的有效方法。带有重组T-DNA的大肠杆菌质粒衍生载体称为”中间载体”（intermediate vector），而接受中间载体的Ti质粒则称为受体Ti质粒（acceptor Ti p1asmid），一般是卸甲载体（disa