重组片段的连接重组.pptx

重组片段的连接重组5 DNA片段的连接重组5、1 DNA连接酶的发现1967年,世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶,即DNA连接酶(ligase)。这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH),和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P),只有在这种情况下,才能发挥其连接DNA分子的功能作用在大肠杆菌及其它细菌中,DNA连接酶催化的连接反应,是利用NAD＋[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的;而在动物细胞及噬菌体中,则是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。 DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的ＤＮＡ链必须是双螺旋的一部分。实际上,DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口(nick),即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂。OH P5‘…G--C--T--C--T--G--C--A G--G--A--G … 3’3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’P OHDNA连接酶5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G … 3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C … 5’5、2 DNA连接酶的基本性质修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键nicknickDNA连接酶5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G … 3’3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G … 3’3‘…C--G--A--G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’nickP OH5‘…G--C--T--C--T--G-OHP-C--A--G--G--A--G … 3’3‘…C--G--A--G--A--C-POH-G--T--C--C--T--C … 5’DNA连接酶5‘…G--C--T--C--T--G--C--A--G--G--A--G … 3’3‘…C--G--A--G--A--C--G--T--C--C--T--C … 5’连接多个平头双链DNA分子5、3 分类DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体能源辅助因子NAD+ATP功能催化DNA粘性末端的连接粘性末端、平末端均可连接5、4 DNA连接酶的反应体系10×连接缓冲液1、0μL目的序列回收产物5、0μLT4 DNA连接酶(3U/μL)0、5μL双酶切后的植物表达载体3、5μL总体积10、0μL1U DNA连接酶的酶活性:在最佳反应条件下15 ℃反应1 小时,完全连接1μgλ-DNA(HindIII片段)所需的酶量某植物表达载体的连接体系连接酶连接切口DNA的最佳反应温度是37℃。然而在这个温度下,粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此,连接粘性末端的最佳温度,应是界于酶作用速率和末端结合速率之间,一般认为4~15℃比较合适。平末端的连接采纳T4DNA聚合酶,可在较高的温度进行,如22 ℃。5、5 体外连接DNA片段的方式粘性末端同种内切酶产生的粘性末端的连接同尾酶产生的粘性末端的连接不同粘性末端的连接平末端的直截了当连接末端修饰后的连接加上连杆( 1inker ),使之形成粘性末端后,再用DNA连接酶连接DNA接头(adapter)连接法具粘性末端的DNA片段的连接比较容易,也较常用。5'GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5'GAATTCCTTAAG5'5'EcoRI 5'5'5'GCTTAAGCTTAAGCTTAAAATTCGAATTCGAATTCGAATTCGAATTCGGCTTAAGCTTAA5'5'5'AATTCGGCTTAA5、5、1同种内切酶产生的粘性末端的连接T4DNA连接酶退火5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'TGATCAACTAGT5'5'BclI BamHITACTAG5'5'5'TACTAGGCTTAAGATCATGATCATGATCATGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAG5'5'5'GATCCGGCCTAG5、5、2同尾酶产生的粘性末端的连接T4DNA连接酶退火5'GGATCCCCTAGGGGATCCCCTAGG5'CTGCAGGACGTC5'5'BamHIPstI CGCTAG5'5'CGCTAGGATCGCGATCGC5'5'CTGCAGCGGACGTCGCGATCCCTAGGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGGATCCC