毛细管电泳学习.pptxVIP

概述 电泳：溶液中的带电粒子（离子、胶粒或分子）在电场中的定向迁移现象。物理化学现象。 毛细管电泳（又称高效毛细管电泳）（HPCE ），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型电泳分离技术。 包含电泳、色谱及其交叉内容。 电泳法（electrophoresis）以电泳为基础的分离分析方法。 第1页/共135页 电泳法的发展史(Phylogeny)： 电泳现象早在18世纪就被发现。 1909年，L.Michaelis提出“电泳 (electrophoresis) ”这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。 1937年，瑞典科学家A.Tiselius 成功研制出界面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的分离。 Tiselius于48年获诺贝尔化学奖。 第2页/共135页 花絮 1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白； 发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定； 第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪； 1948年，获诺贝尔化学奖； 1.经典电泳技术 利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。 经典电泳法 自由界面电泳（无载体电泳） 区带电泳（有载体支持电泳） 第3页/共135页 界面电泳 ：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。 缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难 第4页/共135页 区带电泳： 是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。 避免对流的干扰。 纸电泳 醋酸纤维素电泳 淀粉凝胶电泳 琼脂糖电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第5页/共135页 常压电泳：电位梯度  50V/cm 高压电泳：电位梯度  50V/cm 影响因素： 电荷效应 溶液pH值 离子强度和温度 电渗 载体性质和分子筛 电泳速度 电场强度 V/L(V/m) 电泳速率 第6页/共135页 传统电泳的缺陷： （1） 焦耳热效应：电流通过电泳介质而产生的热效应。 使电泳分离介质温度分布不均匀，引起溶液对流，从而导致区带展宽，降低分离效率。焦耳热效应随电场强度的增大而迅速加剧，限制了高电压的使用。 （2）无法在线检测，定量精度较差。 第7页/共135页 2.高效毛细管电泳技术 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径的石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达40万/m，使电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。 毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压，全面改善分离质量和提高分析速度。 第8页/共135页 总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点有四个：高效、快速、微量和自动化。 毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，可以使用很高的电压。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。 高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进： 一、采用了50 m内径的毛细管； 二、采用了高达数千伏的高电压； 三、实现了高灵敏度的在线检测。 第9页/共135页 1981年，Jorgenson．和Lukacs 使用75μm内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽，成为高效毛细管电泳划时代的里程碑。至此，出现了毛细管电泳技术。 80年代以来，诞生了很多新的毛细管电泳方法，如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。 88年商品化HPCE问世，高灵敏度柱上检测器的发展使HPCE在世界范围内蓬勃开展。HPCE已成为电泳领域发展最快的新分支。 毛细管电泳的发展 第10页/共135页 高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较 （1）分离过程： 相同 HPCE 与HPLC 都是一种液相分离分析技术。都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述,如保留值、塔板理论和速率理论等。 （2）分离原理：不同（驱动力不同） HPCE：带电粒子在电场中发生定向移动，依据粒子所带电荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。 　HPLC：不同组分在两相中的分配系数不同而分离。 第11页/共135页 （4）应用：二者相互补充 HPCE在生物大分子分离方面，在分析速度和效率、样品和试剂用量方面有优势，但在样品制备和定性、定量重复性等方面不及HPLC。 （3）仪器流程：基本相同 都包括进样装置、分离柱、检测器和数据记录处理等部分。 第12页/共135页 1.分离