病理方法学学习.pptx

病理组织学常用制备技术;固定方法有：①物理学方法，如低温冷冻，干冰（dry ice，即固态无水碳酸）冰冻真空脱水，石蜡渗入法。 ②化学方法，采用各种化学溶液作固定液，使组织细胞进入固定状态。这是国内最常用的方法。;固定注意事项;（二）?常用固定液及其配制;乙醇 无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。;中性甲醛液（混合固定液） 甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4·H2O）4g，磷酸氢二纳（Na2HPO4）13g。此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。 4%多聚甲醛固定液 固定液配方：40g多聚甲醛，溶于1000ml，的PB液，不容易溶解，放于密封瓶中，60℃温箱过夜即可溶解，也可以加温至60℃，搅拌溶解。;AF液（混合固定液） 95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5ml。 此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。 以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。;常规石蜡切片操作 ;组织脱水 ;浓度与时间;组织透明;（四）组织浸蜡;（五）组织包埋;注意事项;Masson 染色;Masson染色 （1）常规脱蜡至水：二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ10 min→100%酒精Ⅰ5 min→100%酒精Ⅱ5 min→95％酒精3 min→90％酒精3 min→80％酒精3 min→70％酒精3 min→蒸馏水1 min （2）Masson染色：Masson复合液5 min→自来水过洗2次→0.2%醋酸Ⅰ1 min→0.2%醋酸Ⅱ1 min→自来水过洗1次→1%磷钨酸6 min→自来水过洗1次→亮绿15min→自来水过洗2次→0.2%醋酸Ⅰ1 min→0.2%醋酸Ⅱ1 min→自来水过洗1次 （3）常规脱水透明：70%酒精30 s→80％酒精30 s→90%酒精30 s→95％酒精30 s→100%酒精Ⅰ5 min→100%酒精Ⅱ5 min→二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ10 min→中性树胶封片;石蜡标本中RNA的提取; 在实际临床病理诊断和病理回顾性研究中，来源最丰富、最容易获得的是经过石蜡包埋保存的档 案组织。 ;与DNA相比较，RNA很不稳定，容易受 到环境温度、酸碱度等因素的影响，尤???是无处不 在的RNA酶对它的降解破坏，使得长期以来，对 RNA的研究材料都仅限于培养细胞或新鲜组织，至少是冰冻组织，影响了对它的研究应用。 ; 以石蜡包埋组织为研究材料，在文献报道的基础上，对石蜡组织RN A的提取方法进行改进和完善，拟建立 一套在石蜡包埋组织中提取RN A的有效方法。;方 法;RNA 提取;(2)脱蜡:加入二甲苯，室温。离心， 8600 r/min 10 min ,离心3次。若脱蜡仍 不理想则将EP管置于37℃孵箱15 - 20 min, 再以上述转速离心8min. (3)清洗:加入无水乙醇室温.离心， 8600 r/min, 10min,离心3次。 (4)干燥:弃出管中酒精，开盖，置T- 37℃孵 箱，20min。 ;( 5 )消化:加入组织裂解缓冲液(20 mmo1/L Tris, pH 8.0, 20 mmo1/LEDTA,pH 8.0% SDS, pH 7.2) 200 - 250 vl混匀，加入蛋 白酶K(终浓度400mg/L),置于58℃烤箱或 水浴振荡摇床进行组织消化至液体清亮。 消化时 间根据组织类型而定; ( 6)灭活蛋白酶K:将消化后的组织置于95℃水浴锅， 水浴lOmin, ;(7)加入TRIZOL 试剂，混匀，室温孵育 10min (8)加入氯仿 200 ul 用力震荡后静置3min,4℃, 13000 r/min 离心15min (9)吸取上层水相，加入等体积异丙 醇，混匀，置于一20C沉淀RNA,2h。 4℃, 13 000 r/min 离心15min; ;(10)弃上清，加入1. 2 ml 75%的酒精(0.1%DEPC处理水配制)，离心，4C，11000r/min,10 min (11)弃上清，倒置悬空离心管，干燥8 min (12)加入0.1% 的DEPC处理水，58℃， 10min以溶解RNA。对上述方法提取