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第五章 工程育种 Genetic engineering 重组 DNA 技术： binant DNA technology 工程：是将不同生物的 在体外人工剪切组合并和载体（质粒、 噬菌体、 ）DNA 连接，然后转入微生物或细胞内，进行扩增，并使 转入的 在细胞内表达，产生所需要的蛋白质。 克隆的酶学基础 克隆载体 目的 的获得 重组体 DNA 分子的构建及导入受体细胞 重组子的筛选 工程研究进展及应用 一、奠定 工程的三项 1．DNA 的特异切割 Smith 和 Na ns 获 1978 年 医学奖 2 ．DNA 的分子克隆 Berg(1972)将猴 SV40 DNA 与λ噬菌体 融合，组建成功 DNA 的重组体； Cohen 和 Boyer (1973)将质粒 pSC101 与 R 的tetrkmr 融合， 并将重组体 DNA 转化 E.coli，首次实现了DNA 的分子克隆。 3 ．DNA 的快速 Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法 DNA 快速 技 术 1980 年 化学奖：Berg, Gilbert, Sanger 二、 工程操作的主要步骤 1.分离或 ； 2.通过体外重组将 载体； 3.将重组 DNA 导入细胞； 4.扩增克隆的 5.筛选重组体克隆; 6.对克隆的 进行鉴定或 ； 7.控制外源 的表达； 8.得到 产物或转 动物、转 植物 第一节 克隆的酶学基础 一、核酸内切酶与 DNA 分子的体外切割 核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核 酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。 核糖核酸酶（RNase） 脱氧核糖核酸酶（DNase） 核酸外切酶：exonuclease 核酸内切酶：endonuclease （一）限制性核酸内切酶——restrictive endonuclease 简称限制性酶（restrition enzyme) ：是一类能够识别双链DNA 分子 中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA 双链结构的核酸限制性内切 酶。 是微生物细胞中用于专门水解外源 DNA 的一类酶 是避免外源 DNA 的干扰或噬菌体的 ， 是细胞中的一种防御机制 1、寄主控制的限制与修饰作用（R / M） （1）寄主控制的限制作用 （Restriction） 作用：破坏外源 DNA，使之迅速降解 机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进行切割 （2）寄主控制的修饰作用（Modification） 作用：保护自身的 DNA，使之不受限制 机制：甲基化酶，催化 S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到限制酶识别序列的特 定碱基（A 或 C) ，使之甲基化。 2. 限制性核酸内切酶的类型 特性 Ⅰ型 Ⅲ型 功能 限制、修饰 限制 限制、修饰 蛋白质 3 种不同亚基 单一成分 2 种不同亚基 结构 所需辅 ATP, Mg2+, SAM Mg2+ ATP, Mg2+, SAM 助因子 识别序 EcoB: TGA(N) TGCT 4~8bp, 旋转 EcoP1: