细胞因子及抗体检测技术.pptxVIP

细胞因子及抗体检测技术; 细胞因子的检测方法: 1) 生物学方法 ①依赖性细胞株 :生物分析法 ②功能检测 :生物分析法 2) 分子生物学方法 ①分子杂交技术 :mRNA表达水平的测定 ②多聚酶链反应技术(PCR):mRNA的测定 3)免疫学方法 ①免疫测定 :免疫酶技术 ②功能测定与抗体抑制 ;抗体检测技术 免疫酶技术 免疫荧光技术 间接血凝试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定 ; 酶联免疫吸附测定实验 (ELISA) Enzyme linked immunosorbent assay ; ;管晓虹(1946-2012),女,汉族,江苏丹阳人,博士,教授,博士生导师。农工民主党员。农工民主党第十二、十三届中央常委,第九、十届全国人大代表,江苏省妇联副主席。;实验原理;实验原理;方法类型;一、试剂及仪器准备;⑵ 载体性能比较 要求:载体材料+、- 结果差别大 检测方法:10ug/L IgG包被,加酶标抗IgG,显色后,测20孔的OD,要求CV10% ⑶ 常用载体: 材料:聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状:小试管、小珠、微量反应板 ;2、 Ag或Ab:纯度高、效价高、结合力高 3、 免疫吸附剂(固相Ag或Ab): 包被:将Ag或Ab固相化的过程包被缓冲液、包被方法 封闭:包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被,以消除非特异吸附的干扰 ;㈡ 酶结合物: 1、 要求:纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定 2、 常用酶:HRP、AP、?-半乳糖苷酶等 3、 底物: HRP可溶性底物及呈色: 邻苯二胺(OPD):橙红(492nm);四甲基联苯胺(TMB):蓝色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA):棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2:荧光 HRP不可溶性底物及呈色: DAB:棕黄色 α-萘酚:红色 3-氧基-9-乙基卡唑:红色 4-氯-1-萘酚:灰蓝色 AP可溶性底物及呈色: 对硝基苯磷酸酯(P-NPP):黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP):荧光 AP不可溶性底物及呈色: NBT和BCIP混合液:紫色 牢固红和萘酚ASMX混合液:红色 ?-半乳糖苷酶: 4-甲基伞基-?-半乳糖苷:荧光 ;4、 酶结合物的制备: 戊二醛交联法 过碘酸盐氧化法 ;(三)设备:酶标比色仪简称酶标仪 指测读ELISA光度计;针对固相载体形式的不同,各有特制的适用于板、珠和小试管的设计 性能指标:测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性 优良的酶标仪的读数一般可精确0、001,准确性为±1%,重复性达0、5% 操作:室温宜在15-30℃,使用前先预热仪器15-30min,测读结果更稳定。测读A值时,要选用产物的敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读;二、操作步骤(间接ELISA法);(一)样品的收集和保存:;(二)包被;　; 最适工作浓度的选择 可用棋盘滴定法在夹心ELISA法中选择包被抗体和酶标抗体工作浓度,即利用棋盘滴定,将包被抗体和酶标抗体稀释成一系列浓度,反应后显色。阳性值在0、8左右,阴性值小于0、1为最适,可据此选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度 ; 方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原的工作浓度 用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后,按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释的强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对比),保温,洗涤。加工作浓度酶标抗体,洗涤,加底物显色,加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值;为0、8左右,阴性参考血清A值0、1的包被抗原稀释度为工作浓度　　;(三)封闭;(四)加样(抗原或抗体);对比设定;(五)加酶标抗体;(六)显色;(七)结果判定; 定性测定 定性测定的结果判断作出“有”或“无”的回答,分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中,将标本作一系列稀释后进行试验,呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。依照滴度的高低,能够判断标本反应性的强弱,这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义 在间接法和夹心法ELSIA中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反,阴性孔呈色深于阳性孔;2、 定量测定 ELSIA操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别是固相载体