tailpcr原理及应用学习.pptxVIP

在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA 序列邻近的未知序列。 热不对称交错PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未DNA 序列的分子生物学技术。 在分子生物学研究领域中,利用该技术分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制的探针,也可以直接测序。 该技术技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。 ;结构;;第1 次PCR 反应 由5 次高特异性反应、1 次低特异性反应、15 次热不对称的大循环构成。通过5 次高特异性的反应,使sp1 与已知的序列退火并延伸,提高目标序列的浓度。1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上, 随后进行15 次TAIL 循环。经过上述反应得到了不同浓度的3 种类型的产物:特异性产物和非特异性产物(Ⅰ 型和Ⅱ型);第2 次反应 将第一级反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过15 次热不对称的大循环,使特异性的产物被选择性地扩增,而非特异性的产物被压制到极低的含量。;第3 次反应 又将第2 次反应的产物稀释1000 倍作为模板,通过15 次热不对称的大循环。;通过上述3 次PCR 反应可获得较高含量的与已知序列邻近的目标序列。;TAIL-PCR 引物设计;;TAIL-PCR 反应条件; TAIL-PCR 技术优缺点;缺陷： (1) 反应条件设置要求精细，因为TAIL-PCR 是3 轮连续的嵌套的反应。若是其中一轮出现失误，将会直接影响下一循环的工作。 (2) TAIL-PCR 反应需要较多的引物组合，因为不同的AD 引物具有不同的结合位点。 (3) TAIL-PCR 反应不是每次都有阳性结果。因为AD 引物存在有限的结合位点，在个别侧翼序列的扩增中，即使使用不同的简并引物也难以获得阳性结 ;优化 优化TAIL-PCR反应的一些环节，可大大增加反应产物的特异性;TIAL-PCR 的应用;第15页/共16页;谢谢您的观看！