基因组文库构建.pptxVIP

cDNA文库(cDNA library) ： 克隆的重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。 cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,扩增出多 克隆的过程，最终可建立cDNA文库。 ;建库的目的： 1.从复杂的基因组中分离单拷贝的基因； 文库中分离稀有的cDNA克隆。 建库的关键： 如何产生足够数量的重组DNA 建库应注意： 和靶DNA均不被外源DNA序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。 ;; 第一节 DNA克隆片段的产生与分离;2.随机片段化： 超声波：可产生300bp的短片段。 高速搅拌：1500转/分×30分 可切 平均长度8kb的分子群体。 单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考虑到载体容量，如?噬菌体插入片段不超过25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平均长度4096 bp. ;双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb,但如采用双酶部分消化，产物的分子量可达10～30kb,它们存在着随机序重叠，用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片段群体按大小分开，可得到的分子量大小约为20kb的随机DNA片段群体。 二. DNA片断大小的分部 如已知含目的基因克隆片段的大小范围，可在克隆前用蔗糖梯度离心或琼脂糖凝胶电泳将DNA群体按大小分部分离。 三.目的基因克隆片段的富集。 ;;将数据代入上式 = 8.1×105 N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时，所构建的基因文库数必须在 8.1×105 以上时，才能以99％的概率得到此克隆。;五. cDNA文库;cDNA文库的优点;但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。 (3)cDNA文库的DNA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。 ;;;第二节 构建文库的载体; 置换载体—Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“ 填充片段”gam和red基因座丢失引起的。 供体DNA的大小： 插入载体：0-10kbp; 置换载体：9-23kbp。 插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105％所限制。 主要应用： 插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。 置换载体:基因组DNA克??。 ;二. 粘粒(cosmid)载体 基础：包含λ噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转染宿主细胞； 载体筛选：类似于质粒 重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选； 供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105％所限制。 主要应用：基因组文库构建。 ;;文库;;(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体DNA。 ;;;(2) P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs) 基础：噬菌体P1 导入宿主：体外包装和转导 载体筛选：显性选择标记 重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选 供体DNA大小：约100kbp 主要应用：大基因组分析 评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。 ;(3)酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YACs) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复) 重组筛选：插入片段大小 供体DNA大小：2000kbp 主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠 评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。 ;;第三节 文库的筛选;;;探针的特异性可通过以下的策略来解决： ①选基因的特异序列为探针； ②长度不低于17～20Nt