电泳影响因素.docxVIP

在电泳过程中，带电粒子的移动速度v除与粒子所带电荷量Q及电场强度X有关外，还与粒子半径r及介质的粘度η有关： v=QX/6πrη上式中，6π是适用于球形带电粒子的阅历数值，对椭圆形或半径很大的粒子则数值有所不同。可见，带电粒子的移动速度和粒子的本身的性质有亲密关系，粒子表面所带电荷量和物质的组成结构有亲密关系。此外，粒子的大小（分子量）及粒子的外形等也有重要的影响。所以，在肯定电场强度下，不同种类的带电物质在电泳时的移动速度就不能完全全都，这种移动速度的差异就是电泳技术的基本依据。 1.样品带电化合物的性质在几个方面影响着它们的迁移率。（1）电荷：迁移率随净电荷的增加而增加。电荷的大小一般由pH打算。（2）分子大小：对于较大的分子，由于四周介质所引起的摩擦力和静电力的增加，迁移率下降。（3）外形：同样大小的，但是具有不同外形的分子，如纤维状的蛋白质和球状蛋白质，因摩擦力作用不同，而表现有不同的迁移特征。 2.电场欧姆定律表示了电流A（安培）、电压V（伏特）和电阻Ω（欧姆）之间的关系：A＝V/Ω。因此，离子在电场中的分别受到这三个因素的影响。（1）电流：由于在二个电极之间溶液中的电流完全由缓冲液和样品的离子来传导，因此，迁移率与电流成正比。离子迁移的距离与通电时间成正比。因此，为了得到最好的重复性，在电泳时电流必需保持恒定。当然必需使用直流电。（2）电压：电压掌握着电流，因此，迁移率与加在支持介质两端的电位差成正比。这是电压梯度，一般用伏特／厘米（V/cm）来表示（即，所加的电压除以支持介质的长度）。可以使用低电压（100－500伏），或者高电压（500－10,000伏），电压梯度分别可达20和200伏/厘米。高电压主要是用于分别小分子的化合物。（3）电阻：迁移率与电阻成反比，电阻由支持介质的类型和大小，以及缓冲液的离子强度所打算。电阻随支持介质的长度而增加，随支持介质的宽度和缓冲液离子强度的增加而降低。在电泳时以A2Ω瓦特的比率产生热，并且电阻随温度上升而下降。因此，假如电压保持不变，那么这种温度的上升将会引起电流的上升，并且促使了支持介质上溶剂的蒸发。为了尽可能得到可重复的结果，使用经过稳定的电源装置，尽管由于温度的波动，不行避开地会引起电阻的转变，但是这种电源能自动地保持电压或者电流的恒定。用一个密闭的盖子罩住电泳槽以削减蒸发。在电泳槽中附设一个冷却系统，在高压工作时起到外加冷却的作用。 3.缓冲液缓冲液打算着并稳定着支持介质的pH，并且通过许多途径也影响着化合物的迁移率。（1）成分：通常所用的缓冲液是甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、巴比妥盐和磷酸盐、Tris、EDTA和吡啶。硼酸缓冲液常常用于碳水化合物的分别，由于它们能和碳水化合物产生带电的复合物。由于缓冲液是样品的溶剂，因此，不行避开的会有肯定强度的样品集中。特殊值得留意的是像氨基酸和糖一类的小分子。让样品走成很窄的带，避开过度的加样；在一个尽可能短的时间内使用高电压；以及在分别完成后快速地取出并干燥等都能缩小集中的适度。（2）浓度：由于缓冲液离子强度的增加，缓冲液所载的分电流也随之增加，样品所载的电流则降低，因此而减缓了样品的迁移率。增加缓冲液的离子强度也增加了总电流，因而增加了热的产生。在低离子强度时，缓冲液所载的电流下降，样品所载的电流增加，因此加速了样品的迁移。低离子强度的缓冲液降低了总电流，结果削减了热的产生，但是集中较严峻，使辨别力明显的降低。所以，选择离子强度时必需两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02~0.2之间。离子强度＝CZ21Σ2，C是离子的克分子浓度，Z是它所带的电荷。（3）pH：像无机盐那样的完全离子化的化合物，pH的作用不大。但是对于有机化合物，pH打算了它的电离程度。有机酸的电离随pH的增加而增加，有机碱则相反；因此，它们的迁移程度由pH打算。对于像氨基酸一类既有碱性也有酸性的化合物（两性电解质），两种作用都有。因此，两性电介质迁移的方向以及迁移的程度由pH打算，依据分别的需要可以使用pH从1－11范围内的缓冲液。在两个蓄水槽中的缓冲液一般是相同的，用来饱和支持介质，但是，在凝胶电泳中，缓冲液是支持介质的一部分，因此，在凝胶中常常使用一种与缓冲液槽中不相同的缓冲液。这样能使电泳得到很好的辨别率。 4.支持介质虽然使用了比较惰性的材料作为支持介质，但是介质的精确结构对一种化合物的迁移率有许多影响，而对介质的选择取决于所用的样品类型。（1）吸附：正如吸附层析一样，这是支持介质对样品分子的滞留作用。它导致了样品的拖尾，使样品的移动像一个彗星，不能形成一条很清楚的带，因而降低了分别的辨别率。吸附也降低了总的迁移率。纸的吸附最大，但使用醋酸纤维素实际上可以消退这种作用。（2）电渗（电内渗）：这种现象是