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江南大学科技成果一一谷氨酸棒杆菌医药蛋白表达体系 工程简介 谷氨酸棒杆菌被广泛用于食品工业生产，是一种安全性很高的工 业菌株；具有包括Sec和Tat分泌途径在内完善的蛋白分泌系统；没 有类似于大肠杆菌（E.coli）所带来的内毒素和宿主细胞蛋白污染等问 题。这些显著优点使它成为一种有吸引力的外源蛋白表达生产用的底 盘细胞。目前国内生物医药领域主要依赖于E.coli表达体系生产医药 蛋白，原创性外源蛋白表达体系的缺失，在知识产权方面将制约到我 国生物医药产业的开展。该项成果有望为我国生物医药产也提供一个具有自主知识产权的谷氨酸棒杆菌安全高效外源蛋白表达体系。 CORYNEXFC. glutamicum)AJINOMOTOFermentorSimplePurificationActive target proteins in the supernatantCell RemovalActive InactiveProteins Proteins***谷氨酸棒杆菌表达系统下游蛋白别离纯化过程 CORYNEXFC. glutamicum) AJINOMOTO Fermentor SimplePurification Active target proteins in the supernatant Cell Removal Active Inactive Proteins Proteins * ** 比较内容 大肠杆菌 谷氨酸棒杆菌 参考文献 ■内毒素 有 无 Yim. S. S.. S. J.An. eta/. (2013) 可溶性表达 易形成包涵体 可溶性表达 An. S. J.. S. S. Yim. etal. (2013) 分泌到胞外的内源蛋白 较多 较少 Matsuda. Y., H. Itaya, etal. (2014) 细胞外蛋白酶 有 检测不到 Date. M.. H. Itaya, efa/. (2006) 分泌蛋白的稳定性 不稳定 稳定 An. S. J., S. S. Yim. et al. (2013) 分泌蛋白的纯化 较复杂 较简单 Matsuda. Y.. H. Itaya, etal. (2014) 大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌表达系统比较 特别是2020年国家推出全面禁止在动物饲料中添加抗生素的政 策，极大增加了我国畜牧业对兽用细菌疫苗的需求。兽用疫苗中，利用细菌表达系统生产的基因工程疫苗因交叉免疫效果好在预防禽畜 疫病方面具有广阔应用前景。利用C.glutamicum表达系统生产兽用疫 苗蛋白，可以降低内毒素，强化可溶性表达，简化下游蛋白别离纯化 过程，表现出了显著的过程集成效应。 通过近年来团队的不断努力，我们初步开发的基于谷氨酸棒杆菌 的可溶性高效蛋白表达体系已成功地解决了多家医药企业的生产过 程技术与知识产权问题，比方目前利用谷氨酸棒杆菌宿主所构建的猪 胸膜肺炎疫苗蛋白Omp、脑钠肽BNP、前胶原肽PINP分泌表达工程 菌株均已具备工业应用潜力。 谷氨酸棒杆菌表达医药蛋白的应用 创新要点 该工程利用先进的合成生物学、分子生物学以及高通量培养筛选 系统，创制了具有自主知识产权的谷氨酸棒杆菌安全高效外源蛋白表 达体系，处于国际先进水平。 技术上创新：本工程开发了适合谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达的元 器件、基因编辑工具以及高效的底盘细胞。具体包括双顺反子表达结 构、高效的组成型和诱导型启动子、能够正确引导重组蛋白分泌的高 效信号肽以及适用于C.glutamicum的CRIPSR-Cas9基因编辑工具，并 将其应用到宿主细胞的改造中。在底盘细胞改造方面，基于改造底盘 细胞代谢流趋向于重组蛋白表达有利方向的研究思路，通过转录组、 多变元分析等方法寻找改造底盘细胞的遗传位点，构建了显著提高重 组里白表达的一系列突变体菌株。 结果上创新：目前国内外药用蛋白的表达生产主要依赖于大肠杆 菌表达体系，形成了系列化专利壁垒，而我国在原创性外源蛋白表达 体系研究领域的落后和菌株知识产权的缺乏，已经呈现出制约到我国 生物医药产业健康开展的态势。本工程以具有自由知识产权出发菌株 为基础，基于系统的细胞工厂创制技术体系，能够从源头上规避许多 已有的基于生物学“知识”的基因工程和代谢工程手段所形成的 专利壁垒，为我国药用蛋白的生产提供了一种高效自主的微生物表达 体系。 关键指标 （1）蛋白产品无内毒； （2）目标蛋白产量到达工业生产需求； （3）蛋白纯化生产工艺简单； （4）产品质量稳定可控、生产本钱低。 知识产权 一种适用于谷氨酸棒杆菌的表达载体及其应用，ZL201610626318X； a-淀粉酚的制备，ZL201610836135.0； 一种适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体，CN201910187914.6； 一种谷氨酸棒