泛素化蛋白检测方法.docxVIP

泛素化蛋白检测方法 蛋白质泛素化简介 蛋白质泛素化修饰过程在人体免疫系统调节过程中起到了关键性的作用。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。 泛素蛋白是一个由 76 个氨基酸残基组成的非常保守的多肽，它能在 E1、E2、E3 酶等一系列酶促反应催化下与细胞内靶蛋白上的一个或多个赖氨酸残基发生共价连接。泛素蛋白本身也含有 7 个赖氨酸残基，因此它们之间也可以通过这些位点互相连接，形成多泛素蛋白链（polyubiquitin chain）。目前研究显示，如果多泛素蛋白链与被修饰蛋白上的第 48 位赖氨酸残基相连，会介导靶蛋白进入蛋白酶体而被降解；如果与被修饰蛋白上其它位点，比如第 63 位赖氨酸残基相连， 则靶蛋白可以发挥信号通路功能而不会被降解。 与磷酸化修饰途径一样，泛素化修饰途径也是可逆的，即可以通过去泛素化酶（DUB）将泛素蛋白修饰物去除掉。靶蛋白经泛素化途径修饰之后，连接在靶蛋白上的泛素蛋白单体或多聚体可以被各种泛素蛋白结合结构域（ UBD）所识别和结合。人类蛋白质组中含有两种 E1 酶、50 种 E2 酶、600 种 E3 酶、90 种 DUB 酶和 20 种 UBD，这说明泛素修饰途径在细胞调控中起到了多么重要的作用。E3 酶是泛素修饰途径中决定底物特异性的关键酶，它可以分为两大类， 即含有 HECT 结构域的 E3 酶和其它含有 RING 结构域或 RING 样结构域（比如U-box 或 PHD 结构域）的 E3 酶。这两种 E3 酶都在免疫调控过程中起到了关键性的作用。 蛋白质泛素化的检测方法 研究蛋白质的泛素化首先需要明确的三个基本点：哪些蛋白发生了泛素化； 发生了泛素化的蛋白质，具体是哪个位点的赖氨酸残基发生了泛素化；进行定量。 明确了上述几点后，进一步需要弄清楚的是，我们感兴趣的泛素化蛋白，是如何发生泛素化的，影响这一泛素化过程的关键分子是什么？或者说这一过程中的 E3 酶是什么？ 然后需要研究的是，这一蛋白质发生泛素化之后可以产生那些分子效应？对下游的信号通路有什么影响？ 研究上述内容的实验方法和实验流程： 方法一：western blot and strip 通过 WB 检测所有发生泛素化的蛋白条带，拍照后，将膜 strip。然后与特定蛋白的抗体和特定泛素化位点的抗体反应，显色拍照。通过阳性条带的对比来初步判断某一特定蛋白的特定位点发生了泛素化。【具体实验流程附后】 方法二：western blot and immunoprecipitations 通过免疫共沉淀方法将某一特定蛋白以及与其结合的蛋白分离出来。分离出来的蛋白再进行 SDS 电泳和 western blot 分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确具体哪个蛋白的哪个赖氨酸残基发生了泛素化修饰。 方法三：in vitro ubiquitination assay 将要研究的目的基因转染 293 细胞，使其大量表达。24h 后提取并分离目的蛋白。在体外反应 buffer 中将我们要研究的蛋白 A（被泛素化的那个蛋白） 与 UBE1，UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex ，HA-ubiquitin 以及我们要研究的蛋白 B（引起蛋白 A 泛素化的蛋白），共同进行孵育。将孵育后的产物进行 IP 和 WB 分析。【具体实验流程附后】。这一方法可以明确引起哪个蛋白是引起某蛋白发生泛素化修饰的 E3 连接酶。 方法四：in vitro ubiquitin-binding assay 将我们要研究的蛋白（被泛素化的蛋白）基因转染 293 细胞，大量表达后提纯。或者直接提取内源性蛋白。在体外与K63- or K48-linked ubiquitin chain petides 孵育，然后通过 SDS 电泳并用泛素化抗体进行检测。这一方法可以明确要研究的蛋白哪个赖氨酸残基容易发生泛素化。 方法一：WB strip 实验流程 提取组织/细胞的总蛋白使用总泛素化抗体检测所有发生了泛素化的蛋白（此时可以观察到发生了泛素化的蛋白主要分布在哪些分子量区间）Stripping the blot用特定蛋白的抗体与膜反应显色用 Ub K63 抗体与 提取组织/细胞的总蛋白 使用总泛素化抗体检测所有发生了泛素化的蛋白 （此时可以观察到发生了泛素化的蛋白主要分布在哪些分子量区间） Stripping the blot 用特定蛋白的抗体与膜反应显色 用 Ub K63 抗体与膜反应显色 Merge 如果总的泛素化蛋白的条带，与特定蛋白的条带，以 如果总的泛素化蛋白的条带，与特定蛋白的条带，以及 K63 位点泛素化条带发生了重合，此时可以初步推测，特定蛋白的第