南方医大癌生物学讲义07-2抑癌基因的发现与探索.docxVIP

第七章（2） 抑癌基因的发现与探索 “通过上一讲，我们知道：杂合性缺失的发生频率远高于基因突变的发生频率，这就意味着野生型?Rb基因的丢失可能更多地依赖于杂合性缺失，而不是通过直接的基因突变。普遍认为，大多数视网膜母细胞瘤细胞都会在13号染色体Rb基因及其附近的区域（13号染色体长臂l区4带（13q14)）存在杂合性缺失，而不是在这一位置发现由两次独立的事件所产生的、两个突变位点不同的Rb等位基因。” 图7-2-1：Rb位点杂合性缺失的实证：五核苷酸序列最初表现为异源杂合子的形式（上方），但在经历了导致Rb基因发生杂合性缺失的过程之后也同样呈现出杂合性缺失的形式 1、通过杂合性缺失寻找抑癌基因 癌基因经常在逆转录病毒的基因组中被发现，可以通过转染实验来验证它们的克隆形成能力，或者通过检测它们是否存在于肿瘤染色体的扩增区域来鉴定。与之形成鲜明对比的抑癌基因，只有当它们从基因组上丢失时才能体现自身价值的基因，我们该如何发现它们呢？在肿瘤形成过程中，抑癌基因倾向于在邻近的染色体区域发生杂合性缺失，这为肿瘤研究人员提供了一种新的遗传学方法来寻找它们：通过在特定类型肿瘤发生过程中总是发生杂合性缺失的无名遗传标志物附近寻找，有可能会发现尚未被克隆的抑癌基因。在一部分个体当中，某DNA片段能够被限制性内切酶剪切；而在其他个体中，同样的DNA片段由于在限制性内切酶识别位点单个碱基的替换而无法被切割。类似于这样的遗传可变性在人类基因库中是由正常的遗传变异引起的，这些位点代表了遗传标志物的多态性。鉴于这些序列存在着可被内切酶剪切和不可被剪切两种不同的结果，我们将其称为限制性（内切酶）片段长度多态性(RFLP)。 图7-2-2：限制性片段长度多态性(RFLP)：母源（红色）DNA片段可以被EcoR I酶切割，而其同源的父源（绿色）片段由于单核甘酸的替换而无法切割。使用一个能识别父源片段右侧末端的放射性探针，通过Southern杂交分析能够确定剪切是否发生。本例中，两例肿瘤患者的正常组织DNA在该染色体区域均呈杂合性。然而，在他们的肿瘤DNA中发生了杂合性缺失。 肿瘤遗传学家通常利用RFLP来判断在某种肿瘤的发生过程中染色体不同区域是否频繁地发生了LOH。下图显示了用RFLP技术在一组结直肠肿瘤中寻找LOH的结果。大部分染色体的长臂和短臂都用了至少一个RFLP标志物来标记，以便研究整条染色体的变化。值得注意的是，在人类的多种肿瘤中发现17号染色体的短臂(p)和18号染色体的长臂(q)均存在异乎寻常的高LOH发生率，这两条染色体臂的缺失率均远高于肿瘤细胞中平均15%~20%的染色体LOH发生率。 图7-2-3：肿瘤抑癌基因定位：染色体长臂和短臂分别以绿色和橘色条状图表示。纵坐标显示的”等位缺失”即LOH。（由于当时只有极少数的探针可用于检测染色体层面的LOH, 因此该分析对于关键性的抑癌基因的定位并不精确） 这一事实为这两条染色体臂中发生LOH的区域还存在其他尚未明确的抑癌基因提供了有力证据。因此，遗传学定位为那些在基因组中寻找与结直肠肿瘤发展密切相关的抑癌基因的基因克隆学家提供了明确的指示线索。 2、抑癌基因突变遗传能解释多种家族性肿瘤 和Rb基因一样，大多数已经被克隆的抑癌基因都与家族性和散发性肿瘤的发生有关。一般而言，遗传了上述有缺陷的基因拷贝都能极大地增加罹患某种特定类型肿瘤的风险，而该类型的肿瘤在正常人群中则通常比较罕见。在某些患者中，如果突变发生在胚系等位基因中，将会导致对多种类肿瘤易感。 表7-2-1：部分已被克隆的人类肿瘤抑癌基因（TSG） 当遗传了一个突变的TSG等位基因时可能会增加罹患肿瘤的风险，但反之则不然：并不是所有的家族性肿瘤综合征都存在遗传性的TSG等位基因。由于肿瘤的发生取决于个体体细胞基因组的累积突变，因此减少体细胞基因如这些维持基因组稳定性的基因的突变频率具有高效的抑癌功能。相反，基因组的不稳定性会增加基因的突变率，从而使罹患肿瘤的风险大幅度增加。因此，人们认识到体内存在着两类不同的家族性肿瘤基因：本章讨论的抑癌基因及将在第12章介绍的基因组稳定维持基因。抑癌基因是通过影响细胞的增殖、分化或死亡来直接调控细胞生物学行为的，有时也被称为看门基因（gatekeeper gene),以表明它们在决定细胞是否进入生长和分裂周期过程中所起到的关键作用。基因组维持基因则只通过调控细胞内基因突变累积的速率来间接地影响细胞的生物学行为，又称为看护基因（caretaker gene)。 3、启动子甲基化是抑癌基因失活的一种重要机制 在哺乳动物类细胞中，当鸟嘌呤5端的胞嘧啶（CpG序列）甲基化发生在启动子附近时，它能够引起相应基因的转录抑制。大量研究显示：基因组DNA的CpG修饰是导致抑癌基因沉默的重要途径之一。在一些肿瘤的形成过程中，经