《单克隆抗体技术》.ppt

编辑课件 （三） 细胞融合 融合过程须注意问题 1、细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞比例为1：4 2、反应时间：混合细胞的离心管中30s内加入1ml 37℃预温的50％PEG，边加边轻轻摇动离心管，作用90s，然后加入预温的37℃的DMEM不完全培养液终止PEG作用，800r/min离心6min，弃上清。 3、培养液成分 （四）筛选和克隆 有限稀释法(稀释至0.8个细胞/孔) （五） 单克隆抗体的制备和冻存 （六） 单克隆抗体的纯化 （制备方法：体内培养、体外培养） （盐析、凝胶过滤、离子交换层析、 亲和层析、酸沉淀） ★四 、McA制备的基本方法 ★五 、单克隆抗体的应用 1、作为亲合层析的配体 2、 作为生物治疗的导向武器 3、 作为免疫抑制剂 通过亲和层析可从复杂的混合物中分离、纯化某一特定成分 McAb所带药物只作用于靶组织器官 抗人的T淋巴细胞单抗用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应 4、作为研究工作中的探针 5、增强抗原的免疫原性 6、作为医学检验试剂 （1）诊断各类病原体 （2）肿瘤特异性抗原和相关抗原检测 （3）检测淋巴细胞表面标志 （4）机体微量成分的测定 CJ PEB1重组蛋白的表达及单克隆/多克隆抗体的制备鉴定 课题的思路及目的 诱导培养基因工程菌E.coli BL21(DE3) 高效表达CJ PEB1重组蛋白 镍琼脂糖层析柱纯化 表达后的重组蛋白 免疫BALB/C小鼠制备单抗 免疫新西兰兔制备多抗 为建立血清学方法 检测CJ创造条件 PEB1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 常规免疫BALB/C小鼠制备单克隆抗体 -a -b -c -d -a -b -c -d 抗原决定簇 BALB/C a b b c d 脾脏产生各种 B 細胞 与佐剂乳化 免疫 采血收集血清作为筛选时阳性对照 无菌取脾脏收集B细胞 抗原通常有多个抗原决定簇 免疫后 的脾脏 约在两月內 注射四次 PEB1蛋白 -d -a -b -c -d PEB1 蛋白 ELISA HAT PEG 细胞融合 杂交瘤细胞 （亚克隆） (确定只有单个细胞) -d -c -b -a -d SP2/0 骨 髓 瘤 细 胞 B cell 脾 细 胞 培养筛选 只识别一个抗原决定簇 a b b c d 合混胞细 选筛 抗单 运用小鼠单抗分型试剂盒确定杂交瘤细胞所分泌的单抗的亚型。 将建株的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔诱生腹水。 应用间接ELISA法和双向琼脂扩散试验检测的腹水中单抗的效价。通过Western-blot和玻片凝集试验检测单抗的特异性。 三、PEB1蛋白多克隆抗体的制备及鉴定 免疫新西兰兔制备多克隆抗体。 1 2 3 4 1 2 4 3 1 2 3 4 PEB1 蛋白 与佐剂完全乳化 待血凝完全离心收集血清 盐析法粗提兔IgG抗体 编辑课件 第四章 抗体技术 第十章 抗体技术 、抗体类型 1、多克隆抗体(polyclonal antibody) 早期人工制备抗体的主要方法，以相应抗原免疫动物，由此产生的抗体是针对多种抗原决定簇（表位）的混合抗体，故称之为多克隆抗体。 ★ 第二节 抗体制备 优点：来源广泛、制备容易 缺点：特异性不高、易发生交叉反应 多克隆抗体 1890年Behring和Kitasato发现白喉抗毒素，建立免疫疗法，开创了抗体制药之先河。 白喉外毒素→免疫动物→抗毒素→治白喉 Behring (德,1854～1917） 目前治疗性抗体产品：精制破伤风毒素、精制白喉毒素、精制肉毒毒素。 绿脓免疫血浆抗体制剂 多克隆抗体的制备 根据不同的免疫原，选择不同的免疫方案。 免疫方案 免疫途径 免疫程序 动物选择 细胞融合，又称体细胞杂交是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。 在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybrid cell）。 2、细胞融合技术和单克隆抗体 显微镜下细胞融合过程 Muller于1838年观察到脊椎动的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。