番茄黄化曲叶病毒RT-PCR检测方法.pdfVIP

DB45/T 2581—2022 番茄黄化曲叶病毒RT-PCR检测方法 1 范围 本文件界定了番茄黄化曲叶病毒RT-PRC检测方法所涉及的术语和定义，规定了番茄黄化曲叶病双生 病毒RT-PCR检测方法的仪器与试剂、采样与样品处理、病毒DNA提取与检测、PCR扩增检测、结果描述及 判定的要求。 本文件适用于广西壮族自治区行政区域内番茄及其近缘属种植株番茄黄化曲叶病毒的检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 番茄黄化曲叶病 Tomato Yellow Leaf Curl 番茄黄化曲叶病由番茄黄化曲叶病毒 （Tomato Yellow Leaf Curl Virus）引起，主要症状是植株 生长缓慢，节间缩短，植株明显矮化，叶片变小，顶端叶片发黄并且上卷，整片叶萎缩、褶皱，坐果量 减少，果实变小产生畸形，不能正常转色，果实产量和商品性大幅度降低。 4 仪器与试剂 4.1 检测仪器 包括但不限于以下内容： ——PCR仪； ——电泳仪； ——凝胶成像系统； ——高速台式冷冻离心机(最高转速15000r/min 以上)； ——紫外分光光度计； ——超净工作台； ——冰箱(4 ℃和-80℃两种)； ——通风橱； ——微量可调移液器(0.5 μL～10 μL，10 μL～100 μL，20 μL～200 μL，200 μL～1000 μL)； ——配套移液器吸头，Eppendorf离心管(1.5mL)； ——PCR管； ——研钵。 1 DB45/T 2581—2022 4.2 检测试剂 除特别说明外，下列试剂均为分析纯。如下： a) DNA提取液：100mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl,2％(w/v)CTAB， 4％PVP，40mmol/L巯基乙醇； b) TE 缓冲液：含10mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，1mmol/L EDTA-Na2 (pH8.0)； c) 50×TAE 电泳缓冲液：242g Tris，57.1mL冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0)定容至 1000mL，使用时配制成1×TAE稀释缓冲液； d) 溴化乙锭 (EB，1mg/mL)：戴手套(双层)谨慎称取EB 20mg于棕色试剂瓶中，加入20mL无菌 水，溶解后用黑色袋子包好贮于4 ℃备用，每 100mL凝胶加50 μL EB； e) 苯酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)； f) 氯仿：异戊醇(24:1)； g) 异丙醇； h) 70％乙醇：用无水乙醇和双蒸水配制； i) 琼脂糖凝胶。 注：用于DNA提取的移液器吸头、PCR管应经高压灭菌 （(121±2)℃，15min)处理并烘干。 5 采样与样品处理 5.1 采样 5.1.1 检测样品 以单个品种为单位，以1000株为单位，每1000株采10个样，1000株以下10个样 （10株），重点采 集有疑似症状且无其它病虫害的叶片。对无症状植株采用对角线取样法，每条对角线等距离取5个样 （5 株）。 5.1.2 阴性对照样 阴性对照取自脱毒试管苗或种植于网室内的已检测无黄化曲叶病的单株番茄。 5.1.3 阳性对照样 阳性对照选取有矮化、叶片稍褪绿发黄，变小，叶片边缘上卷，叶片增厚等症状的叶片。 5.2 标识与保存 样品统一使用封口袋保存，每个单株样品各置放一个封口袋中，每个品种再统一放在封口袋内。写 好标签，注明采样时间、地点、品种、采集人。确保样品干燥，如能24h送至检测地，则送检样品常温 保存，送至检测地于-80℃保存；超过一个工作日，送检样品采后需马上冷藏，送至检测地于-80℃以 下冰箱保存。应避免反复冻融 （冻融不超过3次）。 6 病毒DNA提取与检测 6.1 DNA提取 6.1.1 取0.2g叶片，放入预冷的研钵，