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PCR的原理和操作过程会计学第一节 PCR技术原理第1页/共18页 聚合酶链式反应（polymerase chain reation,PCR)是一种DNA体外核酸扩增技术。该技术能在短时间内将极微量的目的基因或某DNA片段扩增至十万乃至百万倍，从极微量的标本中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。PCR技术具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。 PCR基本原理PCR基本反应步骤第2页/共18页一、PCR的原理 PCR技术是一种在体外模拟DNA的复制过程的核酸扩增技术。其原理是根据DNA的半保留复制，以及DNA分子在体外不同的温度下双链和单链可相互转变的机制，在体外人为地控制反应系统的温度，使双链DNA变性，成为单链DNA；其次，单链DNA与人工引物链在退火过程中配对结合；最后，在DNA聚合酶的催化作用下，使引物沿单链模板延伸为双链DNA，实现DNA的扩增。PCR三个基本反应步骤构成，即变性、退火、引物延伸。二、三个基本步骤第3页/共18页变性(denaturation)-高温下将模板DNA双链打开 退火(annealing)-引物在较低温度下以共价键结合到模板DNA互补部位 延伸(extension)-TaqDNA聚合酶作用下，不断向引物3’端添加DNTP，DNA链不断延伸反应液中含有所有成分，以温度变化来控制反应阶段：变性95度，退火55度，延伸72度。123高温变性低温退火适温延伸温度94（℃）72552212345时间（min）第4页/共18页重复1~3步25~30轮DNA变性形成2条单链目的DNA片段扩增100万倍以上子链延伸DNA加倍DNA单链与引物复性DNA双螺旋95℃123高温变性低温退火适温延伸重复1~3步25~30轮94温度DNA变性形成2条单链目的DNA片段扩增100万倍以上（℃）72子链延伸DNA加倍55DNA单链与引物复性22DNA双螺旋12345时间（min）第5页/共18页PCR反应条件PCR过程PCR的特点变 性模板DNAPCR的基本原理第一轮扩增DNA引物58℃第6页/共18页PCR反应条件PCR过程PCR的特点退 火PCR的基本原理引物1引物2DNA引物72℃第7页/共18页PCR反应条件PCR过程PCR的特点延 伸PCR的基本原理Taq酶引物1引物2Taq酶95℃第8页/共18页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第1轮结束第2轮开始50℃72℃第9页/共18页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理TaqTaqTaqTaq72℃第10页/共18页PCR反应条件PCR过程PCR的特点PCR的基本原理第2轮结束PCR的基本原理第11页/共18页模板DNA第5轮扩增第6轮扩增第1轮扩增第2轮扩增PCR反应条件PCR过程PCR的特点第3轮扩增第4轮扩增灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA第12页/共18页PCR的特点PCR 的特点第二节　PCR的实验步骤第13页/共18页标准的PCR反应体系第14页/共18页 10X 扩增缓冲液：5μl 模板DNA: 0.1~2μg 引物： 各0.2~1μmol/L 4种dNTP:各200μmol/L Mg2+: 1.5mmol/L Taq DNA聚合酶： 2.5UddH2O补齐 总体积：50μl可以按照比例放大或者缩小体系，不同的PCR反应需要优化按照实验方案进行即可第15页/共18页1.加样将上述总体积为50чl的反应体系加入一无菌0.5ml离心管中2离心将加入的反应物混合均匀后稍离心，加入一滴矿物油覆盖于反应混合物上3扩增在PCR仪上设置PCR反应参数（具体数据根据引物和扩增片段的大小而定）：94℃下加热4分钟左右；依次94℃变性1分钟，45℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，循环32次左右；72℃下保温7分钟，使反应产物扩增充分4PCR扩增产物分析 PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。ＰＣＲ产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法第16页/共18页PCR循环参数（热力学参数） 94 ℃，3min；94 ℃，45s；58 ℃，1min； 循环30次72 ℃，1min；72 ℃，10min；16 ℃保温第17页/共18页 94 ℃预变性，3min使DNA双链完全打