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引物设计原则：
1。长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq 酶的最适温度
2。碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5 个
GC 含量一般40-60%
GC 含量太低导致引物Tm 值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR 的特异性
GC 含量太高也易于引发非特异扩增。3。引物Tm 值 一般要求：55℃-65℃。计算：
对于低于20 个碱基的引物，Tm 值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算
对于较长引物，Tm 值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方
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