双重免疫荧光细胞化学标记方法.pdfVIP

双重免疫荧光细胞化学标记方法 在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色。一般均采用直接法，将两种荧光 抗体(如抗A或抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用 异硫氰酸荧光素（FITC）标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用TM—RITC或RB200标记或PE标记，发红色 荧光，可以明确显示两种抗原的定位。 在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原) ，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用 罗丹明标记，可采用以下染色方法： 1．一步法双重染色方法 先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B) ，按直接方法进行染色。 2 ．二步法双染色方法 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。 结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速 扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物 点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显 微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不 同