《流式细胞仪》PPT课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * 第六章 流式细胞技术的原理与应用 Flow Cytometry 山东师范大学生命科学学院 杨桂文 * 一、流式细胞仪概述 流式细胞仪（Flow Cytometry, FCM）是一种集激光技 术、电子物理技术、光电测量技术及细胞荧光化学技术、单克 隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。所谓流式细胞术，就是 利用流式细胞仪对细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量 分析和分选的技术。 研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球； 研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量。 * 流式细胞仪分为三大类： 台式机，临床型，特点：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学掌握。 大型机，科研型，特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于更广泛灵活的科学研究。 新型流式细胞仪，特点：随着激光技术的不断发展，仪器选用2-4根激光管，最多检测13个荧光参数，加上散射光信号可达到15个参数同时分析。还可以实验现高速分先，速度达到50000个/s，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。 * 液流系统 光学系统 电子系统 分选系统 二、流式细胞仪的结构组成 Principles of Flow Cytometric analysis * 三、流式细胞仪的基本结构 液流系统 液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子通过激光束。 * 光学系统由光学激发器和光学收集器组成。光学激发器包括激光和透镜，透镜用于形成激光束，并使之聚焦。光学收集器则由若干透镜组成，用于收集粒子发射的光束---激光束相互作用，透镜组和滤片发送激光束至相应的光学探测器。光平台的设计可实现以上功能。 * 光学系统 * 分选系统 * Fluorochrome specification * 电子系统负责光电转换和数据处理 1 散射光信号 激发光 光散射分析：从非均一的细胞群体中鉴别出某些亚群 侧向角散射光 （SSC） Side Scatter：细胞粒度及细胞内相对复杂性 前向角散射光（FSC） Forward Scatter：细胞相对大小及其表面积 * 外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后） 白细胞 淋巴细胞 单核细胞 粒细胞 根据散射光信号 从人白细胞中鉴别出不同亚群： 流式细胞仪的信号分析 * 流式细胞仪的信号分析 2荧光信号 利用荧光标记的特异性单克隆抗体，做单/多色分析： 检测多种细胞表面标志，定量细胞抗原表达、细胞因子水平 为PCR、FISH 等分子技术分选出纯度高的特异细胞群 * 荧光信号的分析 流式细胞仪的信号分析 * 数据存储: LIST MODE 数据显示: 直方图 ( Histogram ) 二维点图(Dot Plot) 等高线图(Contour Plot) 密度图 (Density) 三维图（3D Plot）等 流式细胞仪的数据分析 * 1.什么是传统机械按键设计？ 传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功能的一种设计方式。 传统机械按键设计要点： 1.合理的选择按键的类型，尽量选择平头类的按键，以防按键下陷。 2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公差，以防按键手感不良。 传统机械按键结构层图： 按键 开关键 PCBA 点图分析 流式细胞仪的数据分析 * 流式细胞仪的工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定 压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓 冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与 待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕 着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细 胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 * 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 * 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连