HXY基因的重组与转移.pptxVIP

HXY基因的重组与转移会计学第1页/共65页第2页/共65页重组DNA技术、基因工程 分（离目的基因） 切（割目的基因和载体） 接（连目的基因和载体） 转（化宿主细胞） 筛（选阳性克隆） 基本模式第3页/共65页第一节 DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第4页/共65页1. 两段DNA的连接依靠粘性末端第5页/共65页2. DNA片断与载体的连接依靠粘性末端第6页/共65页第7页/共65页ligasenick第8页/共65页二、平齐末端（blunt end）的连接1. 直接连接5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。5’ 5’ P--OH3’ P--OH3’ HO-HO--P-P3’ 5’ 5’ 3’ 5’ P--OH3’ -PHO-3’ 5’ 第9页/共65页2. 人工加尾形成 “粘性末端” （1）同聚加尾 法 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。①原理：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。②加尾—碱基互补分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。第10页/共65页③优点：能把任何片段连接起来④缺点：不能把插入片段再切下来。非酶切位点第11页/共65页（2）衔接物(linker)连接① linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：② linker的作用用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。第12页/共65页 第13页/共65页 第14页/共65页③优点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。2）能给载体连接上Polylinker:④缺点：如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段第15页/共65页（3）DNA接头 (adapter)连接法1978年康耐尔大学的吴瑞教授发明。① adapter一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。5‘p-GATCCCGG-OH3’ GGCC-p5’ BamHI adapter② adapter的作用用T4DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。第16页/共65页P-5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’ -PBlunt-ended DNABamHI adapter5‘p-GATCCCGG- GGCC--CCGG -GGCCCTAG-P5’ CCGG GGCCCTAG-P5’ 5‘p-GATCCCGG- GGCC-接头自我连接CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5’ 第17页/共65页第18页/共65页③优点：连上后就能用。④缺点：接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。⑤防止自我连接先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5’端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）第19页/共65页 P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5’ 5‘p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-PCIP处理 5’CCGG-OH HO-GGCCCTAG5’ 5‘GATCCCGG-OH HO-GGCC5’ -OH CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5’ HO-接头之间不能形成磷酸二酯键自我连接！第20页/共65页5’p-GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC-p5’ BamHI adapterCIP处理Blunt-ended DNA-OHP-5’GATCCCGG-OH3’ HO-GGCC5’ -PHO-T4 ligase缺口 5‘GATCCCGG- HO-GGCC CCGG-OH -GGCCCTAG5’ 缺口虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。第21页/共65页三、PCR产物的连接1. 在引物的5’端设计酶切位点（1）设计原则符合载体的多克隆位点；避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）第22页/共65页3’ 模板3’ 模板5’--3’ 引物1互补序列GCAGAATTC EcoRI位点复性3’ 模板5’--3’ GCAGAATTC 互补序列延伸3’ 模板5’-GCAGAATTC 互补序列 PCR产物-3’ 第23页/共65页3’ 模板3’ 模板引物23-’ 互补序列GCTAGCCGG -5’ BamH I 位点复性5’ 模板3’-互补序列