荧光免疫标记技术.pptVIP

记录收集管的OD495读数与OD280读数， 根据公式： 2.87×OD495 F / P = —————————— OD280－0.35×OD495 计算F/P值，并对该比值作一简单分析。 【结果判断】 荧光抗体的鉴定 效价 抗体效价可以用琼脂双扩散法进行滴定，效价大于1:16者较为理想。 荧光素与蛋白质的结合比率 荧光素与蛋白质结合比率（f/p）的测定和计算 f/p值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，反之则越少。一般用于固定标本的荧光抗体以f/p＝1.5为宜，用于活细胞染色的以f/p＝2.4为宜。 抗体工作浓度 抗体工作浓度的确定方法类似ELISA间接法中酶标抗体的滴定。将荧光抗体自1:4～1:256倍比稀释，对切片标本作荧光抗体染色。以能清晰显示特异荧光、且非特异染色弱的最高稀释度为荧光抗体工作浓度。 荧光抗体的保存 应注意防止抗体失活和防止荧光猝灭。最好小量分装，－20℃冻存，这样就可放置3～4年。在4℃中一般也可存放1～2年。 【影响标记的因素】 温度: 温度低则所需标记时间长，温度高则标记时间短。在0-4 ℃时标记体需搅拌6-12h,而在7-9 ℃时搅拌4h即可, 20-25℃1-2h，37℃30-45min pH 值: pH低时，标记较慢，pH值偏高（大于10），抗体易变性，pH值9.0-9.5最为适宜，在弱碱性条件下FITC易溶解，同时免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于两者结合。 反应液中荧光试剂和免疫球蛋白的比例: 抗体蛋白含量低，标记慢，以每毫升含20-25mg蛋白为宜。 【注意事项】 严格掌握整个反应体系中的抗体蛋白含量，可提高标记效率。 装柱及上样操作参照实验一。 最后洗脱时应注意掌握洗脱速度及每管收集量。  荧光免疫标记技术 免疫标记（immunolabelling technic） 是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。 通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化测定。 可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上对抗原、抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法对体液中的半抗原、抗原进行定性和定量测定。 具有高度敏感性、特异性、快速性。 免疫标记技术主要分为： 免疫荧光技术： 放射免疫测定：自动化仪器价格昂贵、所用试剂半衰期短、危及人体健康 酶免疫技术：敏感、快速、简便、应用范围广、不需特殊设备 免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理以及相应的检测仪器的使用方法。 免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique） 是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。 免疫荧光标记技术 始创于20世纪40年代初，1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。当时由于异氰酸荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC）。Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。 免疫荧光技术- 基本原理 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。 发生原理：基态?激发态 产生特点：激发---即刻产生 停止激发---瞬间消失 种类：光致荧光，化