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PCR实验及结果分析会计学第1页/共43页目 录PCR技术历史 PCR的原理PCR的反应体系和方法PCR的类型和应用TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG解旋酶ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’解链酶3’DNA解旋解链3’5’合成引物子链延长第2页/共43页DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史5‘5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCGGAUCGRNA引物3’DNA解旋解链AUCGCG5‘3’5’RNA引物合成引物子链延长第3页/共43页DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史引物酶引物酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGAUCGTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATAGCGTAGCTGCGAGGATCG5‘ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’3’DNA解旋解链AUCGCG3’5‘3’5’合成引物子链延长第4页/共43页DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史DNA聚合酶DNA聚合酶1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……第5页/共43页DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖第6页/共43页DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明PCR技术简史PCR技术简介-定义 第7页/共43页 PCR: polymerase chain reaction 聚合酶链式反应 PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的两条DNA链为模板，在一对人工合成的寡核苷酸引物的介导下，通过耐高温DNA聚合酶的酶促作用，快速特异地扩增出特定的DNA片断。 简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向DNA合成。第8页/共43页第9页/共43页第10页/共43页 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。 PCR技术简介第11页/共43页PCR反应所用酶： 早期的PCR方法采用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片断催化退火的寡核苷酸引物进行延伸反应。由于该酶会在进行DNA变性的温度下失活，所以在每一轮合成反应中都须重新加1份酶。并且在扩增较长模板是效果不够理想，产率较低，有一些错配，导致产物大小不均一。 耐热DNA聚合酶是从一种嗜热细菌－嗜热水生菌种提纯出来的，经95℃持续温育仍有活性，不会在加热变性中失活，故无需每轮反应都重新加酶，又由于寡核苷酸引物的退火和变性可以在更高温度下进行，使引物和模板间的误配大大减少，提高了扩增反应的特异性和产率，并且可以扩增更长的产物。第12页/共43页Taqfile:///D:\日常教学\dmt\PCR-附件-1.ppt DNA聚合酶（thermus aquaticus)100 80 60 40 20酶活性(%)40 50 60 70 80 90 100温度(℃)第13页/共43页94℃55℃72℃PCR循环适温延伸低温退火高温变性3211234594温度72（℃）5522时间