基因工程 酵母基因表达体系P学习.pptxVIP

基因工程 酵母基因表达体系P会计学第1页/共58页发展历程1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿酒酵母中存在质粒。1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷，标志着酵母表达系统的建立。1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人干扰素。我国也在1983年首次用酵母菌表达了乙型肝炎病毒表面抗原基因。1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。第2页/共58页酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统优势在于：安全无毒，不致病；有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作；容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，多数酵母菌可以取得较高的转化率；培养条件简单，容易进行高密度发酵；5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中；有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。缺陷在于：表达效率相对低2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工修正。第3页/共58页酵母菌的基因工程酵母菌作为基因工程受体菌的特征酵母菌表达外源基因的优势全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉能将外源基因表达产物分泌至培养基中不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）酵母菌是最简单的真核模式生物酵母基因组特征第4页/共58页 与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基因组很小，仅有16条染色体，含107 bp,编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。这就克服了在其它真核生物中隐性基因控制的形状难以检测的缺陷。第5页/共58页酵母菌的宿主系统广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4.减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 第6页/共58页广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：酵母属 如酿酒酵母克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母汉逊酵母属 如多态汉逊酵母 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因最理想第7页/共58页提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变突变 产生的异源蛋白 增加产量（倍数） 作用位点SSC1凝乳酶原Ca2+-ATPase 牛生长因子3-10转录后SSC2凝乳酶原 转录后 牛生长因子rgrl 鼠α—淀粉酶5-10转录后osel β—内啡肽7-12转录后NDS人血清蛋白 溶酶原活化剂抑制因子2型10转录ss1l α1 —抗胰蛋白酶P 人溶菌酶10羧肽酶Yrho人溶菌酶10转录 人表皮因子NDE第8页/共58页抑制超糖基化作用的突变宿主菌 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖链两部分组成。 酵母菌普遍拥有完整的糖基化系统，但野生型酿酒酵母对异源蛋白的糖基化反应很难控制，呈超糖基化倾向，因此超糖基化缺陷菌株非常重要。突变类型 生物效应mnn甘露糖生物合成缺陷型alg天门冬酰胺侧链糖基化缺陷 och外侧糖链添加缺陷型 靶蛋白Ubiquitin 76 aaLysLysHOOCUbiquitin ligase E3 靶蛋白Lys Ubiquitin ligase E3 靶蛋白Lys蛋白酶体第9页/共58页减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素介导的蛋白质降解作用第10页/共58页如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种降解作用减少到最低程度：第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用;第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失;第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变株作为外源基因表达的受体细胞;第11页/共58页在酿酒酵母中，