大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化.pptx

会计学; 实验目的 实验原理 实验试剂 实验步骤 注意事项 ;;二、实验原理; 转化（transformation） 是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。  进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。; 转化的方法： 化学方法(热击法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体DNA分子导入受体细胞； 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 ;CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法使用更广泛。;克隆的筛选： 主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。;重组DNA转化 细菌过程示意图;三、实验试剂;四、实验步骤;③ 彻底弃去上清液，再加入冰冷的／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ；④ 4000r／min离心10min；⑤ 弃去上清液，加入冰冷的2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。;质粒DNA的转化 ① 分别用2个100μl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作： 第一组，质粒DNA组：10μl pBS质粒DNA +100μl感受态细胞悬液 第二组，空白对照组，10μl无菌水＋100μl感受态细胞悬液 ;②将以上各样品轻轻混匀，冰上放置30min，于42℃热激90s，然后迅速冰上冷却2min； ③立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培 养基（在超净工作台操作，不需要在冰上），使总体积到，摇匀后于37℃振荡培养约30min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Amp)； ;④在超净工作台取各样品培养液在平板上涂布，分别接种于含Amp抗菌素的LB平板培养基上（做好标记，日期）,涂匀； ⑤在菌液完全被培养基吸收后，培养皿倒置于37℃培养箱中过夜(12-16小时)； ⑥观察转化子出现的情况，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养。;五、注意事项;②感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。 ③为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。 ④尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。 ;六、质粒DNA转化常见问题;七、问题与讨论; 如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有Amp的LB固体培养基上生长，如图2。