大肠杆菌感受态细胞的制备与转化.pptx

会计学;1、学习掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法 2、学习和掌握热激法转化大肠杆菌的原理和方法 3、把实验六连接反应产物进行转化实验 ;1）相关名词概念 将质粒导入大肠杆菌或其它细胞内的过程叫作转化。 与噬菌体不同，质粒本身不具备感染细胞的能力。为了使细胞能吸收外来DNA，必须改变其细胞生理状态，使之具有很高的接收外源DNA的能力，这种具有接收外源DNA能力的细胞叫感受态细胞。 2 ） CaCl2- 热激法转化原理 CaCl2能改变细胞膜的通透性，大肠杆菌经低渗CaCl2溶液致敏处理，就变成高效的感受态细胞；感受态细胞与质粒混匀于0℃时，混合物中的DNA形成抗DNase羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，再经42 ℃短时热激时进入细胞内实现转化，利用质粒上的遗传选择标记在LB平板上进行初步筛选转化菌落。; 1、材料 菌株： TOP10 质粒：pBI121-chs(实验六连接反应产物) 2、试剂 LB液体培养基、LB/Amp(100ug/mL)固体培养皿、灭菌2、灭菌去离子水 ;实验步骤;（二）热激法转化E.coli TOP10 1）将连接产物10μL转移至装有200μL感受态细胞的1.5mL 离心管中，轻轻混匀（并设置1管负对照：200μL感受态细胞悬液+10μL无菌双蒸水）； 2）冰浴30min后，42℃热激90sec, 冰浴2min； 3）加入800μL无抗生素的LB液体培养基，在37℃小于180rpm下振荡培养0.5~1小时； 4）复苏后的菌液在4000rpm下常温离心3min，吸取上清液900μL留约100μL 菌液在离心管底部，并用移液枪轻轻吹打重悬； 5）用移液枪将重悬菌液移入带有相应抗生素（Amp:100μg/mL,平板表面涂有20mg/mL的X-gal 40μL和20mg/mL的IPTG 40μL）的37℃保温的LB固体培养基平板上，用灭菌的涂布器涂布均匀； 6）将平板倒置于37℃恒温箱中培养12～18小时。; 实验预期结果;作 业