实验五原核表达.pptxVIP

会计学;一、原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 使用含有十二烷基硫酸钠（ SDS）和还原剂（通常为巯基乙醇）的样品处理液对蛋白质样品进行处理（一般煮沸3-5分钟），通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。;; 蛋白质在电场中的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。加入SDS（十二烷基磺酸钠）和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与原来所带电荷、分子形状无关。;电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。;第6页/共19页;二、试剂;;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：试剂;样品缓冲液：1 mL 4×Tris·Cl/SDS(pH 6.8)，1 g SDS，2 mL β-巯基乙醇，1 mL 0.1%溴酚兰，5 mL 甘油，加蒸馏水定容到50 mL。 电极缓冲液：0.6 g Tris碱，2.88 g甘氨酸，0.1 g SDS 固定液：50%甲醇，10%冰醋酸 染色液：0.05%(w/v)考马斯亮蓝R-250，50%甲醇，10%冰醋酸 脱色液：7%冰醋酸，5%甲醇 ; 三、设备;第12页/共19页;四、步骤;3.原核表达;;;SDS胶配方;2) 考马斯亮蓝染色 （1）：将聚丙烯酰胺凝胶用固定液固定2 h； （2）倾去固定液，以考马斯亮蓝染色液染色4 h。 (3)倾去染色液，加入脱色液，缓慢摇动脱色。中间换脱色液，脱色到获得蓝色条带及干净的背景为宜。