DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤.docVIP

v1.0可编写可更正 DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方 法步骤 琼脂糖凝胶电泳是用于分别、判定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂 中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在 碱性条件下（pH80的缓冲液）带负电荷，在电场中经过凝胶介质向正极挪动，不一样DNA分子片段因为分子和构型不一样，在电场中的泳动速率液不一样。溴化乙锭 EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照耀后，可分出不一样的区带，达到分别、判定分子量，挑选重组子的目的。 一、实验目的 学习和掌握琼脂糖电泳法判定DNA的原理和方法。 二、实验原理 琼脂糖凝胶电泳是用于分别、判定和提纯DNA片段的标准方法。琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（的缓冲液）带负电荷，在电场中经过凝胶介质向正极挪动，不一样DNA分子片段因为分子和构型不一样，在 电场中的泳动速率液不一样。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫 外线照耀后，可分出不一样的区带，达到分别、判定分子量，挑选重组子的目的。 三、实验资料 实验14提取的DNA样品， 四、用具及药品 电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠，EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。五、实验步骤 1、安装电泳槽 将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的张口封好，放在水平的工作台上，插 上样品梳。 2、琼脂糖凝胶的制备 1 v1.0可编写可更正 称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，（按的琼脂糖含量，1-25kb大小的DNA用1%的凝胶， 20-100kb的DNA用%的凝胶，200-2000bp的DNA用%的凝胶）置微波炉或开水浴中加热至完 全熔解（不要加热至沸腾），拿出摇匀。 3、灌胶 将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。 4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，而后拔出梳子。 5、加样 将DNA样品与加样缓冲液（loadingbuffer）按4：1混匀后，用微量移液器将混杂液加到 样品槽中，每槽加10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。 6、电泳 安装好电极导线，点样孔一端接负极，另一端接正极，打开电源，调电压至3-5V/cm，电泳 1-3hr，当溴酚蓝移到距凝胶前沿1-2cm时，停止电泳。 7、染色和观察 拿出凝胶，放在含有溴化乙锭的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外灯下观察，有橙 红色荧光条带的地点，即为DNA条带，或在紫外灯下照相记录电泳图谱。溴化乙锭是致癌剂， 操作时要当心，一定戴手套。 附： 5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制(1000ml)： Tris54g，硼酸，LEDTA20ml，将pH调到，定容至1000ml，4℃冰箱保存，用时稀释 10倍。 ⑵加样缓冲液的配制： %溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。 ⑶溴化乙锭的配制： 称取溴化乙锭，溶于10ml水，配成终浓度为10mg/ml的母液，4℃冰箱保存。染色时，汲取 μl的母液，加入250ml的水中，使其终浓度为μg/ml，混杂平均。 ⑷100倍TE缓冲液的配制： 1mol/LTris-HCl（），100mmol/LEDTA 称取，，先用800ml双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至（大体加入盐酸20ml）， 而后定容至1000ml。 ⑸100倍电泳缓冲液的配制： 4mol/LTris-HCl（pH8..0），2mol/L醋酸钠，200mmol/LEDTA 称取，无水乙酸钠，，先用 400ml 双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调 pH至（大体加入 冰乙酸50ml），而后定容至 500ml 。用时稀释100倍。 2