《生化分离技术》4.4 细胞色素C的制备及测定.pptVIP

一、 实训目的： 1、学习细胞色素C的理化性质及其生物学功能。 2、掌握制备细胞色素C的原理 3、掌握制备细胞色素C的操作技术。 二、 原理： 细胞色素C是一种能够传递电子的含铁卟啉蛋白质。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。 它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochrome c，CytC）只是细胞色素的一种。 它在呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间。 线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。 bǔ 分子质量约为12000～13000道尔顿； 蛋白质部分由104个左右的氨基酸残基组成，其中赖氨酸含量较高，等电点10.8，含铁量0.37-0.43%。 易溶于水，酸性溶液中溶解度更大 对热、酸和碱都比较稳定，但三氯乙酸和乙酸可使之变性，引起某些失活。 传递电子作用是由于细胞色素C中的铁原子可以进行可逆的氧化和还原反应，故可分为氧化型和还原型。 还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素c制成还原型； 氧化型细胞色素c在408nm、530nm有最大吸收峰； 还原型细胞色素c的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm。 细胞色素C的性质 酸性水溶液提取。 细胞色素c溶液用于各种组织缺氧急救的辅助治疗； 一氧化碳中毒、催眠药中毒、氰化物中毒、新生儿窒息、严重休克期缺氧、脑血管意外、脑震荡后遗症、麻醉及肺部疾病引起的呼吸困难和各种心脏疾患引起的心肌缺氧的治疗。 原理：在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。通常外源性细胞色素c不能进入健康细胞，但在缺氧时，细胞膜的通透性增加，细胞色素c便有可能进入细胞及线粒体内，增强细胞氧化，能提高氧的利用。 三、试验材料和方法 1、材料： 新鲜（冷冻）鸡心脏 2、试剂 （1）25%(NH4)2SO4，12%BaCl2，联二亚硫酸钠。 （2）人造沸石：白色颗粒， 40-60目。 （3）20% 三氯乙酸（TCA）、1mol/L H2SO4、 1mol/L NH4OH溶液、 0.2% NaCl、 细胞色素C标准液（3mg/ml） 3、仪器： 绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、 透析袋、层析柱、烧杯、纱布等 四、实训方法： 1、材料处理 新鲜或冷冻动物心脏，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞碎。 2、提取： 称取鸡心脏碎肉100克，加蒸馏水800毫升酸化水（水预先用6-8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，用2mol/L的硫酸调pH=4.0（需要不断调整），搅拌提取2小时。 再用1mol/L的氨水调pH=6.0，停止搅拌。四层纱布挤压过滤，收集滤液，离心（4000rpm，2min）。 3. 中和： 用1mol/L的氨水调滤液pH=7.2，利用等电点法除杂蛋白(一些杂蛋白此pH溶解度小)，静置30-40min，使沉淀沉下。虹吸上清夜，过滤（滤纸）除杂质。合并得到的红色清液，测量体积。 4. 吸附与洗脱： 预处理：称取人造沸石11g于500mL烧杯，加水搅拌，除去12s内不下沉的细颗粒。 装柱（酸式滴定管）：向柱内加去离子水至2/3体积，然后边搅拌边连续、均匀地将预处理好的人造沸石水溶液装填入柱，避免柱内出现气泡。装柱完毕，打开柱下端夹子，使柱内沸石面上剩下一薄层水。 上样：将中和好的澄清滤液小心加到沸石上面，勿冲动沸石，使之流入柱内进行吸附，控制流出液的速度1.0ml/min。随着细胞色素C被吸附，人造沸石由白色变为红色，流出液应为淡黄色或微红色。 洗脱： 将红色人造沸石从柱内取出，放入500ml烧杯。依次用自来水、蒸馏水洗至水清，再用100ml 0.2%氯化钠溶液分三次洗沸石，再用蒸馏水洗至水清，按第一次装柱方法将沸石重新装入柱，然后用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于2ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积。洗脱完毕，回收人造沸石，可再生使用。 5. 盐析 为了进一步纯化细胞色素C，向洗脱液中缓慢加入固体硫酸铵，边加边搅拌，使硫酸铵溶液饱和度为45%（每100ml洗脱液加20g硫酸铵）。放置30min以上(最好过夜)，杂蛋白沉淀析出，滤纸过滤（或离心），收集红色透亮的细胞色素C滤液，测量体积。 盐析salting out 高浓度的中性盐可以中和蛋白质表面电荷、夺取蛋白质周围的水化膜，破坏蛋白质在水溶液中的稳定性，从而将蛋白质从溶液中析出。 常用中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等 + + + + + + + 水化膜 6. 三氯乙酸（TCA）沉淀