TUNEL法检测细胞凋亡.pdfVIP

- TUNE L 法检测细胞凋亡 1 原理 TUNEL 〔terminal deo*ynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling, 脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法〕是通过检测细胞凋 亡早期过程中细胞核DNA 的断裂情况来评价细胞凋亡的有效方法。细胞凋亡中 染色体DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA 首先在内源性的核 酸水解酶的作用下降解为 50-300kb 的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA 在 Ca ² 和 Mg² 依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180 ～200bp 核小体式DNA 片段 〔核小体式剪切〕。由于DNA 双链断裂或只要一 条链上出现缺口即可产生一系列DNA 的3’-OH 末端。 增加细胞膜通透性→脱氧核糖核苷酸末端转移酶〔TdT Enzyme 〕和荧光素 〔fluorescein〕标记的dUTP 进入细胞内→在TdT 的辅助下dUTP 与凋亡细胞中 断裂DNA 的 3’-OH 末端结合→ 再用辣根过氧化酶(HRP)标记的抗荧光素抗体与 dTUT 上的荧光素〔fluorescein〕特异结合 〔荧光显微镜观察〕→最后用辣根过氧 化酶底物二氨基联苯胺 〔DAB〕、过氧化氢与HRP 发生氧化、环化反响 ，形成苯 乙肼聚合物而呈现棕褐色→特异准确地定位正在凋亡的细胞→普通显微镜下观察 和计数不同视野中TUNEL 阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。 由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3-OH 形成， 很少能够被染色。适用于组织样本〔石蜡包埋、冰冻和超薄切片〕和细胞样本〔细 胞爬片、涂片〕的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双 色法确定细胞死亡类型和分化阶段。 2 器材与试剂 . z. - 2.1 器材 ： 光学显微镜及其成像系统、染色缸、湿盒、各种规格的加样器及枪头、镊子、 24 孔或6 孔板、盖玻片、载玻片、1.5mleppendorf 管、平皿、吸管、锡纸、摇床、 计时表、荧光显微镜、光镜、 MARKER 笔、冰盒、恒温箱、加湿器、塑料缸、 微波炉等。 2.2 试剂 试剂盒内容：ROCHE 〔10 人份〕 〔1〕50μl 酶浓缩液〔TdT-enzyme solution〕10× 蓝色 来源：小牛胸腺，大 肠杆菌重组 〔2〕550μl标记溶液〔label solution〕1× 紫色，核苷酸混合物 荧光素标记 〔3〕700μl转化剂-POD 〔converter-pod〕即用型 黄色，抗荧光素抗体，来源于 绵羊的 Fab 片段，与 horse-radish pero*idase 偶联 注意：3 个试剂用前-20 度保存，解冻后就都不能反复冻融 ，溶解后只能在4 度保存，1 和2 在4 度放 1 个月或3 放6 个月应该没问题 〔有放3 近 10 个月做 的效果还挺好〕。 1 和2 绝不能一次配好分装，配好后，哪怕立即冻存下次也不能用了。只能 一次融解，按 1 ：9 用多少配多少 ，配好后直到使用时要一直放在冰上 ，余放4 度保存。 需准备试剂 .1 一般试剂：双蒸水、二甲苯、梯度乙醇 〔100、95、90、80、70 ％〕、中性树 胶、盐酸酒精、苏木素染液等。 . z. - .2 黏附细胞、细胞涂片 〔1〕PBS 〔pH7.4 〕 〔2〕封闭液：3%过氧化氢- 甲醇〔新鲜