实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用.pptxVIP

实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用------ 分子生物学实验技术 系列讲座Ⅱ河南农业大学生命科学研究中心 张志坤第一页，共四十二页。 大纲一.原理概述二.操作及结果分析 (一).样品制备 (二).引物及探针的设计与合成 (三).标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物 (四).通道的选择及增益的选择 (五).标准曲线的建立 (六).加样时应注意的细节 (七).阈值的选定 (八).熔解曲线分析 (九).操作流程三.应用 (一).绝对定量分析 (二).相对定量分析及实验方案 (三).SNP检测分析第二页，共四十二页。 一、原理概述1.Real-Time PCR 概论 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 分析。第三页，共四十二页。 一、原理概述2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动 录荧光强度的变化每个循环进行一次荧光信号的收集第四页，共四十二页。 一、原理概述2.定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 (2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于0.99。 (3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。第五页，共四十二页。 一、原理概述3.荧光定量PCR所用的荧光报告基团(1).非特异性荧光标记： SYBR Green (2).特异性荧光标记： TaqMan探针 Molecular Beacon分子信标第六页，共四十二页。 一、原理概述4.非特异性荧光染料---SYBR Green的特性(1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位(2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激后才发 荧光(3).变性时，DNA双链分开，无荧光(4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR GreenSYBR Green第七页，共四十二页。 一、原理概述4.非特异性荧光染料---SYBR Green的工作原理图解5’3’5’3’SGNo EmissionSGSGSGExcitationSGSGSGSGSGSGSG5’3’5’3’EmissionExcitation 伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。第八页，共四十二页。 一、原理概述5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点 优点： (1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜 缺点： (1).对引物特异性