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细胞热迁移实验 细胞热迁移实验（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）原理：特定药 物与目标蛋白结合后，则经过药物处理的蛋白质在蛋白加热过程中比对照组蛋 白更加稳定，换言之，药物与蛋白结合后比不结合的蛋白在同等温度升高的条 件下更难被降解。 实验步骤： 1. 铺细胞（6 孔板），并让细胞长满整个培养皿； 2. 收细胞，弃掉细胞培养液，用PBS 清洗细胞，弃掉PBS，用RIPA lysis buffer 收集细胞到1.5 ml EP 管中 （冰上操作）； 3. 对收集的细胞进行蛋白定量，可使用BCA 蛋白定量试剂盒对蛋白进行 定量，确保接下来实验保持蛋白量一定 （冰上操作）； 4. 室温条件下往1.5 ml EP 管中加入药物进行孵育，同时往对照组中加 入DMSO，共孵育80min （药物的量和孵育时间应做预实验进行筛 选）； 5. 把EP 管里的细胞悬液按每个PCR 管100ul 进行分装，分装好后放置 在PCR 里进行热解实验，温度30°——100°，每10°一个梯度，热 解时间10min； 6. 热解结束后，往每个管中加入SDSbuffer 终止反应10min； 7. 取上清跑Western blot。 热迁移实验中注意要点（预实验探索）： 1. 药物孵育时间； 2. 药物的作用浓度； 3. 加热的温度区间； 4. 加热的时间。 实验结果讨论： 如下图所示，实验组加入GA-D 药物与14-3-3 ε蛋白孵育，对照组加入 DMSO，在30°——100°这个区间内可以看出同等温度下，与对照相比，14-3- 3 ε稳定性远大于对照组，因此得出结论，GA-D 与14-3-3 ε相互作用。