农杆菌感受态细胞的制备原理和实验步骤.pdfVIP

一、目的及要求 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 二、实验原理 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌 株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是 细菌细胞具有的能够接受外源DNA 的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞在加入到低渗的氯化钙溶液 中，0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。 制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于 70℃可保存相当一段时间而不会对其转 化效率有太大影响。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱，70℃超低 温冰柜，分光光度计，接种针，10ml 试管，50ml 离心管，1.5ml 离心管，冰浴， 微量进样器及吸头。以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件： 120℃， 15分钟。 材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 试剂： YEB液体培养基（1升）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g，蔗糖5g， MgSO4.7H2O 0.5g, pH7.0 ，高压灭菌； 链霉素（Sm ）储液：125mg/ml 0.15 N NaCl，高压灭菌。 20mM CaCl2 ，高压灭菌。 四、实验步骤 1. 挑取根癌农杆菌 LBA4404 单菌落于 3ml 的 YEB 液体培养基（ 含 Sm 125mg/l）中，28°C 振荡培养过夜； 2. 取过夜培养菌液0.5ml 接种于50mlYEB(Sm 125mg/l)液体培养基中，28°C 振 荡培养至OD600 为0.5 ； 3. 5000rpm, 离心5min ； 4. 加入10ml 0.15N NaCl，使农杆菌细胞充分悬浮，5000rpm, 离心5min ； 5. 弃上清，置于冰上，加入1ml 预冷的20mM CaCl2，充分悬浮细胞，冰浴中保 存，24 小时内使用，或分装成每管200ml，液氮中速冻1 分钟，置70°C 保存备 用。