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葡萄糖氧化酶检测方法 1.1 酶活力 1.1.1 原理 葡萄糖和氧反应，在葡萄糖氧化酶的作用下，生成葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢和无 色的还原型邻联茴香胺在过氧化氢酶的作用下，生成水和红色的氧化型邻联茴香胺。 N 1.1.2 试剂和溶液 特殊说明，所用的试剂均为分析纯，水均符合GB/T 6682中规定的三级水。 1.1.2.1 磷酸盐缓冲溶液，pH 为6.0。 O 称取二水磷酸二氢钠16.61g和十二水磷酸氢二钠35.82g，溶于无二氧化碳的水中，稀释 至1000mL。 O 1.1.2.2 邻联茴香胺甲醇缓冲溶液。 称取邻联茴香胺1g加入100ml甲醇中搅拌溶解备用。临用时现配，取0.1ml加入到上述缓冲溶液12mL中 N 混匀。 1.1.2.3 葡萄糖水溶液，浓度为180g/L。R 称取葡萄糖18g，加水溶解，定容至100ml。 1.1.2.4 辣根过氧化物酶液,浓度为0.033%。 O 称取辣根过氧化物酶（HRP，美国Ameresco公司）10mg，溶于30ml蒸馏水。 1.1.3 仪器与设备 N a) 分析天平：感量0.0001 g 。 b) pH 计：精确至0.01 。F c) 磁力搅拌器：附加热功能。 d) 电磁振荡器。 e) 离心机：4000 r/min 。 O f) 恒温水浴锅：温度控制范围在30—60℃之间，精度为0.1℃。 I g) 秒表：每小时误差不超过5s。 h) 可见分光光度计：能检测350—800nm 的吸光度范围。 i) 移液器：精度为1uL。 B 1.1.4 实验方法 1.1.4.1 反应用酶液的制备 固态产品用万分级天平称取样品1g （精确至0.0001g），用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）定 容至100mL。磁力搅拌30min，上离心机6000r/min,离心5 min。取上清液，再用磷酸盐缓冲溶 液（2.7.2.1）做适当稀释。 液态产品用移液枪吸取1.00mL，用磷酸盐缓冲溶液（2.7.2.1）做适当稀释。 1 注：稀释后的待测酶液测得的△A值在0.15-0.65。 1.1.4.2 测定步骤 取两支干净的试管，按顺序分别加入以下试剂。实验步骤如表： 空白 样品 1、邻联茴香胺甲醇缓冲溶液（2.7.2.2）2.5mL 1、邻联茴香胺甲醇缓冲溶液（2.7.2.2）2.5mL 2、葡萄糖液（2.7.2.3）0.3mL 2、葡萄糖液（2.7.2.3）0.3mL 3、辣根过氧化物酶液（2.7.2.4）0.1mL 3、辣根过氧化物酶液（2.7.2.4）0.1mL 4、混匀，30℃恒温水浴5min 4、混匀，30℃恒温水浴5min 5、水0.1mL，混匀 5、酶样液0.1mL，混匀 N 6、在460nm下立即读数A ,3min后再次读数A ， 6、460nm调零 0 1 △A=A -A 1 0 每个试样应取两份平行样进行分析测定，吸光度值差值不超过