Nuptec实验技术手册(蛋白方面).pdfVIP

实验一 蛋白是否表达 1.1 实验步骤和所需时间 实验步骤 所需时间 1、用15ml 离心管取5 ml LB 培养基，加相应抗性，挑取4 个转化子37℃ 5-16h 过夜活化。 工作时间或过夜 2 、用15ml 离心管取5 ml LB 培养基，加相应抗性，接种过夜活化的菌 液50ul，37℃摇菌至菌液OD600 为0.8，加IPTG 至最终浓度0.1mM 诱 8h 导4h 。 3、取40μl 菌液于1.5ml EP 管中加入20μl 3 × loading buffer，煮沸。 1h 4 、将煮沸后样品跑SDS胶，每个孔上样量 10-20ul。若目的蛋白 3h 分子量≥15KD，用浓度12%的SDS胶；若目的蛋白分子量＜15KD， 用浓度15%的SDS胶。 5、SDS胶用染色液染色 30min 。 0.5h 6、SDS胶用脱色液脱色 1h。 1h 7、将脱色好的SDS胶拍照保存，分析结果。 10min 8、挑取表达量最高的转化子，保存甘油菌（800ul 菌液加200ul 75%甘油）。 总共时间：2-3 天 1.2 实验所需材料配方 LB 培养基（+抗生素）：LB 配方如下（1L），蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g。 IPTG ：母液浓度为1mol/L。 SDS相关试剂： 30 % 丙烯酰胺贮存液 称取29 g丙烯酰胺，1 g N-N’甲叉双丙烯酰胺，加蒸馏水溶解定容至100 ml （约加65ml ）， 过滤后装入棕色瓶中4 ℃保存； 1.5 M Tris-Cl (pH 8.8) 18.17 g Tris溶于90 ml去离子水，用浓盐酸调pH至8.8，定容至100 ml，4 ℃保存； 1 M Tris-Cl (pH 6.8) 12.1 g Tris溶于90 ml去离子水，用浓盐酸调pH至6.8，定容至100 ml，4 ℃保存； 10 %(w/v) 过硫酸铵(AP) 0.1g加入1.5mlEP管中，加水1ml溶解，4 ℃可保存两周。 10 %(w/v) 十二烷基硫酸钠（SDS） 称取100 g SDS溶于900 ml 的无菌去离子水中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解，用水 定容至1L。 3 ×loading buffer 2.5ml 1M Tris-HCl(pH6.8 同浓缩胶) 、2mg溴酚蓝、2ml 10%SDS 、4ml甘油，加水溶解 并稀释至10ml，此溶液用于非还原型SDS，如用于还原型SDS，则1ml再加 0.2ml β-巯基乙醇。 10×电泳缓冲液 30g Tris, 144g Glycine, 10g SDS, pH8.3 考马斯亮蓝染色液(1L) 考马斯亮蓝R-250 0.1 g 异丙醇 250 ml 蒸馏水 650 ml 冰醋酸 100 ml 过滤，室温保存。 脱色液(1L) 乙醇 50 ml 冰醋酸 100 ml 蒸馏水 700 ml 实验二 蛋白表达在上清还是包涵体中 2.1 实验步骤和所需时间 实验步骤 所需时间 1、配置50 ml LB 培养基4 瓶，121℃灭菌