基因克隆步骤完整版.pdfVIP

基因克隆步骤完整版 精品 1 总 RNA 提取 (1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1ml Trizol 加到离心管中待用 (2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min；打开离心机预冷 (3) 加 200 µL 氯仿，振荡 15 sec，室温放置 3 min，分层； (4) 4oC ，12,000g，离 15 min； (5) 取上清，加 500 μL 异丙醇，混匀，室温放置 10 min； (6) 4oC ，12,000g，离 10 min； (7) 弃上清，加 1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用 100%乙 醇清洗 (8) 4oC ，7,500g，离 5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加 50 μL DEPC 水，－80oC 保存。 此操作中所用到的器皿均需经过 DEPC 灭活 RNA 酶处理。提取的总 RNA 需经 RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260 值为核酸的吸 收值，OD280 值为蛋白的吸收值，OD260/280 值在 1.8-2.0 间一般说明该核酸蛋白 含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有 OD230 值为多糖和酚类的吸收值， 比较干净的核酸 OD260/230 值能达到 2.2 左右。RNA 浓度计算公式：总 RNA 浓 度（µg/mL）=A260 ×稀释倍数 ×40。 -可编辑- 基因克隆步骤完整版 精品 2 反转录/cDNA 第一链的合成 纯化 RNA 以去除基因组 DNA，操作按 TaKaRa 公司的 PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 1μg 5× gDNA Eraser Buffer 2μL gDNA Eraser 1μL RNase Free dH O 补齐至 10μL 2 条件为：42oC ，2min； RNA 纯化后，即可进行反转录。其体系为： 5×PrimeScript Buffer 2 （for Real Time） 4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ 1μL RT Primer Mix 1μL 上一步的反应液 10μL RNase Free dH O 补齐至 20μL 2 操作条件为： (1) 37oC 放置 15 min； (2) 85oC ，5 sec； (3) 4oC 保存。 3 PCR 按 TaKaRa 公司的 Premix Taq Version 2.0 操作，，PCR 反应体系如下： -可编辑- 基因克隆步骤完整版 精品