冰冻切片基质金属蛋白酶原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产品.docx

PAGE PAGE 1 冰冻切片基质金属蛋白酶原位明胶酶谱法荧光染色试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 冰冻切片基质金属蛋白酶（MMP）原位明胶酶谱法（in situ zymography）荧光染色试剂是一种旨在通过异硫氰酸荧光素标记的明胶作为底物，针对未固定处理的冰冻切片予以染色处理，基质金属蛋白酶切离底物产生高度绿色荧光，来定位组织中的基质金属蛋白酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种冰冻动物组织的基质金属蛋白酶-2 和 9 的分析。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，荧光清晰，重复性好。 技术背景 基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。迄今为止发现的 MMPs 至少有 28 种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption ）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将 MMPs 分为 4 大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13 主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶 A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘 连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及 MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT -MMP、 1 MT -MMP、MT -MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备 MMPs，当需 2 3 要 MMPs 的信号传递到细胞后才临时合成，合成的 MMPs 以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的 MMPs 可激活另一种 MMPs，形成瀑布效应。原位明胶酶谱法荧光染色（in-situ fluorescence zymography）技术在于提高基质金属蛋白酶检测的敏感性，使用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的明胶作为底物，经过基质金属蛋白酶水解后产生荧光多肽， 据此在荧光显微镜下检测酶的活性和位置。 产品内容 胶体液（Reagent A） 底物液（Reagent B） 产品说明书 3 毫升 250 微升 1 份 保存方式 保存在－20℃冰箱里， 底物液（Reagent B），严格避免光照，有效保证 6 月 用户自备 复染液（ HL40049）：用于样品复染 1.5 毫升离心管：用于染色工作液配制的容器盖玻片：用于样品孵育处理 微波炉：用于融化试剂 恒温水槽或培养箱：用于试剂温育或孵育反应物荧光显微镜：用于样品染色后观察 实验步骤 实验开始前，准备好 10 张 10 微米厚的冰冻切片。同时室温下融化预热 染色液（Reagent B），避免光照。然后进行下列操作。 将 胶体液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出） 小心移取 400 微升 胶体液（Reagent A）到 1.5 毫升离心管 放进 37℃恒温水槽孵育 10 分钟 同时瞬间 37℃预热 染色液（Reagent B） 加入 50 微升 37℃预热的 染色液（Reagent B），混匀 （选择步骤）加入 1 微升用户自备的复染液 即刻分别加上 40 微升上述液体到未固定的冰冻切片的样品上 盖上盖玻片（注意：避免气泡） 放进 4℃冰箱里孵育 10 分钟，或直至胶体凝结，避免光照 放进 37℃培养箱里孵育 60 分钟，避免光照 即刻在荧光显微镜下观察：激发波长 480nm，散发波长 530nm―― 绿色荧光增强，表明基质金属蛋白酶活性高 注意事项 本产品为 50 次操作 操作时，须戴手套 样品准备要点如下： 冰冻切片须在 8 至 10 微米厚，且未予固定处理 样品中避免使用 EDTA、EGTA 等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和 DTT 等 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR） 如果验证样品中基质金属蛋白酶，可以使用 EDTA 或抑制剂预处理 1 小时作为对照 建议 胶体液（Reagent A）瞬时加热，以防干枯；或采用 60℃度恒温水槽加热融化 建议使用 10 微克/毫升碘化丙啶（Propidium Iodide），作为复染染料 如果样品活性过低，可以增加孵育时间至 24 小时 注意区分样品的自发荧光 染色参考图像如下：绿色荧光为基质金属蛋白酶；红色荧光为碘化丙啶复染 本公司提