CCK-8实验常见问题与解决办法.docx

做实验都会遇到疑惑的地方，那么CCK-8实验中常见的问题有哪些呢？有什么解决办法？下面我们一起学习CCK-8常见问题与解决办法。 ? Q1：CCK-8溶液对细胞的毒性大小如何？ A1：CCK-8溶液对细胞的毒性非常低，通常观察不到细胞毒性。细胞在CCK-8法检测后仍然可以正常生长，并可以用于其它的细胞实验。但为了避免CCK-8溶液可能带来的对于后续检测的影响，除非该细胞极难获得，否则不推荐把CCK-8溶液孵育过的细胞用于其它实验。 ? Q2：做细胞活性检测时，每孔应该接种多少个细胞？ A2：当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔(100 μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔(100 μL培养基)。 ? Q3：在实验中OD值太高，怎么解决？ A3：a.可以缩短加入CCK-8后的培养时间。? ? ? ? b. 适当减少细胞的数量。 ? Q4：在实验中OD值太低，怎么解决？ A4：a.适当增加细胞数量。? ? ? ? b.延长加入CCK-8溶液后的孵育时间。 ? Q5：培养基的本底颜色如酚红会不会影响细胞活性的检测呢？ A5：不会，培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光值而消去，因此不会对检测造成影响。 ? Q6：只可以在450nm波长处测OD值吗？ A6：可以在450nm波长处测OD值，但是若无此波长的滤光片，可选择吸光度在430-490 nm之间的滤光片，但是450 nm滤光片的检测灵敏度最高。 ? Q7：若是暂不检测OD值，该如何处理？ A7：若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。 ? Q8：应该每次做标准曲线吗？ A8：建议每次做。虽然细胞是一样的，但是细胞的状态不一定一样，对于状态不一样的细胞，建议每次做标准曲线。如果试剂的批号不一样，灵敏度可能会有轻微的差异，对于不同的批号建议分别做标准曲线。 ? Q9：CCK-8能否检测细菌细胞？ A9：可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。向100μl大肠杆菌培养液中加入10μl CCK-8溶液，并培养1-4个小时或过夜。 ? Q10：如何减少由于CCK-8试剂在枪头上或孔壁上的残留所带来的误差？ A10：可以在加样前用培养基稀释CCK-8试剂并混匀后加样。 ? Q11：CCK-8能否对活细胞进行染色？ A11：不能。因为CCK-8的主要成分是一种水溶性的四唑盐 (WST-8)，并通过电子载体PMS将活细胞中的电子交换到培养基中的WST-8上。生成的甲臜也是高度水溶性的，因此CCK-8不能对细胞进行染色。 ? Q12：在做加药实验时，药物对测定是否有影响？如何解决？ A12：有时会有影响。如果药物具有还原性，会和CCK-8发生显色反应，增加吸光度。解决办法：首先要确认药物是否有吸收，在含有药物的培养基中加入CCK-8，测定450 ?nm的吸光度，如果它的吸光度比不含药物的培养基 (加CCK-8)的吸光度高，则证明药物有影响，可在加CCK-8之前更换培养基，去掉药物的影响。 ? Q13：每次测定的数值不一样，是什么原因？如何解决？ A13：可能会有以下几个原因：①当在 培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。②有可能会因为CCK-8沾在壁上而产生误差，建议在加入CCK-8后，轻轻敲击培养板以帮助混匀。③每孔的细胞数量过多或过少。请预先在1,000-100,000个/孔?范围内摸索条件。 ? Q14：如何设定空白对照？ A14：在不含细胞的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时，还应考虑药物的吸收，可在不含细胞，加入药物的培养基中加入CCK-8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。 ? Q15：哪些物质会影响CCK-8的测定？ A15：当有还原性物质存在时会影响CCK-8的测定，例如含有维生素C的Glucose等 (一般培养基中的量不多，酚红或血清不影响测定)。在有酚红存在的情况下，会增加空白吸收，但不影响测定，扣除空白吸收即可。 ? Q16：说明书上仅写了96孔板的测定方法，如果使用24孔板或12孔板，应该加多少量CC K-8试剂？ A16：一般情况下建议加入 CCK-8试剂的量是培养基体积的1/10。 ? Q17：必须预培养细胞吗？ A17：不一定。如果要想保持细胞的最好状态，建议预培养细胞。如果不做细胞预培养，细胞内的脱氢酶可能会不稳定。也有人不做细胞预培养，但在做标准曲线和