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蛋白相互作用Pull-Down实验 PAGE PAGE 5 蛋白相互作用Pull-Down实验 实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。 用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽S-转移酶（GST）和多组氨酸（6×His）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和配体（如Ni2+和Co2+）。 重复洗三次。 加入50ul 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心2min。 将洗脱蛋白质与等体积的2×SDS上样buffer混合。 3、检测相互作用蛋白质 将样品煮沸4min，进行SDS凝胶电泳分析。 方法二： 1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠在4℃ 2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4℃ 3、3000rpm在4℃离心5min 4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4℃离心5min，除去上清，重复 5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS电泳分析。 方法三： 实验试剂：PBS（140mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、1.8mM KH2PO4） Elution Buffer: 50mM Tris-Cl(pH8.0)、10mM还原型谷胱甘肽 0.154g溶解到50ml 50mM Tris-Cl(pH8.0)中配制Elution Buffer。 细胞裂解 取1ml细菌培养液离心去上清，加200ul细胞裂解液到菌丸，在室温下重悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育20-30min。 2、固定GST融合蛋白到柱子上 将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。重复洗3次以上。 平衡好的凝胶用100ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。加200ul含GST融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育30min。 小心移去上清，（保存以便分析，）将250ul Binding Buffer或wash Buffer加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer或Washing Buffer再次清洗，将凝胶用20ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。 捕获猎物蛋白 将5ul固定GST融合蛋白的凝胶中加入20ul含猎物蛋白的溶液，将155ul Binding Buffer或wash Buffer和20ul 10%BSA加入凝胶中，在室温下旋转孵育1h。移去上清。 将400ul Binding Buffer或wash Buffer加入凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min，移去上清。加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。小心移去上清。 分析：加20ul SDSloading Buffer，在室温下混合5min。取出上清用于分析。 His Pull-Down方法 实验试剂： Binding Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、150mM NaCl、20mM咪唑 Elution Buffer: 20mM Tris-Cl(pH8.0)、300mM NaCl、500mM咪唑 实验步骤： 1、结合蛋白裂解后，经0.45um滤膜过滤， 2、与Ni-NTA树脂（1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂）4℃ 3、待树脂沉淀后用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。 4、用6倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。 5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。 6、SDS电泳分析 7、纯化的蛋白与Ni-NTA树脂冰浴作用2h， 8、10倍柱体积洗涤缓冲液洗涤， 9、然后加入过量100ug/ml蛋白溶液，冰浴作用2h， 10、用10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗， 11、加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱， 12、洗脱蛋白进行SDS和Western-blot分析鉴定。 13、阴性对照为结合蛋白溶液加入Ni-NTA树脂中冰浴作用2h。10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入1倍柱体积洗脱缓冲液洗脱， 注意事项： 1、所有过柱的液体都要经过0.45um或0.22um的滤膜。 2、平衡柱子： 2.1 用3-5个柱体积蒸馏水洗柱 2.2 用3-5个柱体积的