荧光定量PCR方法：探针法VS染料法？.docxVIP

荧 光定量 P CR 方法 ：探 针法 V S 染料法？ LELE was finally revised on the morning of December 16, 2020 荧光定量 PCR 方法：探针法 VS 染料法？ 荧光定量 PCR 又称 qPCR，是一项非常常见的分子生物学实验技术。荧光定量 PCR 荧光为基础对核酸进行定量分析，其应用非常广泛，可以用于检测基因的表达 量(RNA 的丰度)，验证表达谱芯片或转录组测序的数据，确定病原体的载量，对 片段的拷贝数(CNV)进行分析，对基因进行分型等等。 大部分研究者主要的应用是对基因的表达量进行测定，其原理为通过监控反应 体系中荧光强度的变化，记录检测荧光达到阈值时的循环数(Ct 值)。从理论上 说，起始模板量和 Ct 值密切相关，因此我们通过判读 Ct 值从而对样本进行定 量。 在进行荧光定量 PCR 时，从技术和产品来说，我们往往会有许多选择，尤其 是方法的选择，对最终结果的准确性至关重要。荧光定量 PCR 从方法上来说可以 分为染料法和探针法两种。 探针法 染料法 一、染料法 在国内，染料法一般采用 DNA 染料 SYBRGreen Ⅰ ，染料法使用简单，成本也 相对较低，因此会有很多国内研究者会选择使用染料法进行后续实验。在染料法荧 光定量 PCR 实验中，染料能够与双链结合，从而发光，而在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光。 所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链 DNA 量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。但是染料法检测的是体系中的所有双链 DNA,因此一些非特异性扩增或者引物二聚体的出现，会极大的影响真实结果的准确 性。为此，一些厂商提供 ROX 作为内部荧光参考标准，用来校正背景，但是即便 如此，染料法特异性的问题依旧无法与探针法相比。另外染料法无法在同一个反应 中检测多个目的片段，对于复杂序列，如果难以扩增的话，也会受到脱靶效应(如 引物二聚体)的影响。在这种情况下，就需要在实验前期进行熔解曲线分析，判断 扩增所得产物是否只有一种。 二、TaqMan 探针法 TaqMan 探针法 PCR 扩增时，在加入一对扩增引物的同时再加入一个特异性的 荧光探针。 Taqman 探针为一段线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团 (FAM 或 Hex 等) 和一个荧光淬灭基团，当探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号；当 PCR 扩增时 (在延伸阶段)， Taq 酶的 5 -3 外切酶活性将探针酶切降解， 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分 离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光 分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也就是探针法定 量的原理。 探针法与染料法的最大区别在于， 理论上探针法中的荧光信号只来源于目标序 列，也就是不受非特异性扩增及引物二聚体的影响。 除此之外， 人们还可以利用不 同探针，在一个体系中使用不同的荧光标记同时检测多种指标， 达到节省实验成本 的目的。在样本量比较大的情况下， 成本甚至可以低于染料法。 因此我们可以看到，在选择荧光定量实验时，探针法在特异性和准确性方面远 远优于廉价的染料法，但在实际使用时，TaqMan 探针高昂的价格常常让人望而却 步。目前， 上海捷瑞生物工程有限公司在强大的探针合成能力的前提下， 推出了探 针法荧光定量 PCR 服务，以染料法的价格，享受探针法的服务，在相同的经费情 况下，提高实验的准确性和特异性。