PCR技术及其应用.pdfVIP

第八章 PCR 技术及其应用 PCR （polymerase chain reaction）技术是20世纪 80年代发展起来的新技术，广泛应用于分子 生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的其它领域，如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴 定、新药品的开发等。 PCR技术是通过模拟体内 DNA 复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来 的技术。其过程与普通DNA复制一样有三个步骤，首先是模板DNA变性，由双链状态变成单链状 态;然后引物与模板结合，完成复性过程；最后在 DNA 聚合酶和底物存在的情况下，合成与模板互 补的 DNA。所不同的是，也以另一个引物以另一条链作模板，合成出与第一个产物互补的DNA链， 从而得到这两个引物之间的DNA片段，而且这样的复制过程重复进行。 PCR 过程在自然界是不存在的，它是人们对 DNA 复制的深刻理解而带来的产物。现代 PCR 概念是 Kary Mullis于 20世纪 80年代早期发明的。在 1983年晚春的一个周末晚上，Mullis驾车行 驶在加州 101国道上，随着蜿蜒曲折的道路，头脑浮想联翩，构思出了链式反应的蓝图。经过与 Cetus 公司的同事合作，最终促使现在广泛使用的PCR技术的诞生。 PCR概念的出现与其它许多好的想法的出现一样，是许多成熟技术累积的结果，是科学技术发 展的必然产物。比如寡核苷酸的合成技术、通过 DNA聚合酶用寡核苷酸指导DNA 的合成等。Mullis 的创新点在于使用两个与 DNA 的两条不同链互补的寡核苷酸作为引物特异性地扩增两个引物之间 的DNA区域，并且重复进行。在此同时，得到的扩增产物又可作为下一轮扩增的模板，从而使得扩 增产物按几何级数递增。特别重要的是，从嗜热细菌中分离的耐热DNA聚合酶的发现，使 PCR 概念成为真正适用的技术。 其实在 Mullis提出 PCR概念以前，Khorana等人在 20世纪 60年代末 70年代初就提出了 PCR 技术的概念，只不过当时使用了修复复制的概念。也许是当时科学技术的发展需求不够，没有形成 使其进一步发展的动力，使得Khorana等人的想法被人搁置了 15年。但有一点是不争的事实，正是 由于Mullis及其同事在 80年代的出色工作，才使的 PCR成为当今生物学及相关学科使用最广泛的 技术，使得常规克隆已不再是分离基因的唯一手段，他们在 1993年获得若贝尔奖也是当之无愧的。 第一节 PCR技术原理和工作方式 一、PCR的基本原理 1．基本要素和扩增原理 DNA 的复制是生命活动中最基本的过程之一，PCR就是灵活并发展使用 DNA复制而创造出来 的一项伟大技术。因此PCR 的基本原理离不开DNA复制的基本规律。其基本要素与DNA复制的 基本要素是一致。DNA 复制是通过拷贝的方式将DNA 重新制造一份的过程，待拷贝的DNA 称为 模板。在PCR过程中模板可以是双链DNA也可是单链DNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。 引物是DNA 复制的先锋，就象结晶过程中的晶核，引导DNA 的合成。在PCR 扩增中一般使用合 成的寡核苷酸作引物。DNA聚合酶是DNA复制的动力，在四种脱氧核苷三磷酸酸(dNTP)等底物存 在时，在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链。 与单纯的DNA复制不同的是，PCR扩增总是在两个引物的存在下对DNA 的两条链同时进行复 制，复制的结果得到一条双链DNA。通过仪器的自动控制，使这样的DNA复制重复进行，从而得 到大量的位于两个引物之间序列的DNA片段，即目标片段。更重要的是，在一次扩增得到的DNA 产物又可作为下一轮扩增的模板，导致扩增产物以几何级数递增。 图8-1是PCR扩增前4轮产物的增长过程，每一轮包括3个步骤(变性、退火和延伸)，从中可 以看出PCR 的整个扩增进程。从第二轮开始，出现目标片段，其所占比例为1/4；在第三轮扩增中， 第二轮扩增的产物又可作为模板，此时目标片段所占的比例为1/2；在后续轮次的扩增中目标产物所 占的比例越来越大，依次为 11/16，13/16、57/64、15/16。在指数扩增阶段，目标片段所占比例(P) 可用以下公式计算: p=1-(n+1)/2 , n 为扩增的轮次。当进行到第10轮时，目标片段所占比例可达到n 98.9%。 2．PCR扩增的步骤 首先将模板DNA置于92℃-96℃，进行变性（denaturation）处理，使双链DNA在高温下解链