免疫荧光检测.docx

. . . 免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案） 荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行 鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光 免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例 进行实习。 抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和 RNA 等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。 抗核抗体实验原理 以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如 Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG 抗体又可与ANA 结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。 试剂与器材 抗原片 现多用商品试剂。如需自行制备，方法如下： . 肝印片制备：取 4-8 周龄小鼠，断颈杀死后，剖腹取肝。将肝脏剪成平面块，用 生理盐水洗去血细胞，用滤纸吸干渗出的浆液。将切面轻压于载玻片上，使其在载玻片上留下薄层肝细胞。冷风吹干，乙醇固定，冰箱可保存1 周。 Hep-2 细胞抗原片制备：Hep-2 细胞是建株的人喉癌上皮细胞。经适宜培养在载玻片上形成单层细胞抗原片，用洗涤洗去培养基。干燥后，用无水乙醇固定。 肝切片制备：取小鼠肝组织作冰冻切片，厚4μl。-30℃保存备用。 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗人IgG 抗体(FITC-抗人IgG 抗体)有商品供应， 临用时按效价稀释。 3．0.01mol/L pH7.2 PBS 缓冲甘油 取甘油 9 份加PBS 1 份。 待测血清、阳性和阴性对照血清 临床标本筛选获得。 器材 荧光显微镜、孵箱、有盖湿盒、染色缸、吸管、试管等操作方法 准备：检查加样板，生物载片恢复室温，标记。 稀释：PBS-Tween 缓冲液稀释血清，设阴阳性对照。 加样：加样板放于泡沫塑料板上，加 25μl 稀释后血清，至加样板的每一反应区，避免气泡。加完所有标本后开始温育。 温育：将生物薄片盖于加样板的凹槽里，反应开始，室温温育30 分钟 。 . 冲洗：用烧杯盛PBS-Tween 缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween 缓冲液的小杯中至少 1 分钟。不必混摇。 加样：滴加 20μl 荧光素标记的抗人球蛋白（结合物）至一洁净加样板的反应 区，完全加完方可继续温育。荧光素标记的抗人球蛋白用前需混匀并以PBS-Tween 缓冲液稀释。 冲洗：用烧杯盛PBS-Tween 缓冲液流水冲洗生物薄片，然后立即将其浸入盛有PBS-Tween 缓冲液的小杯中至少 1 分钟。不必混摇。 封片：将盖片直接放于泡沫塑料板凹槽中，滴加甘油/PBS 至盖片：每反应区约 10μl。从PBS-Tween 缓冲液中取出 1 张生物薄片，用纸擦干背面和四边。还要擦拭反应区间隙。将生物薄片面朝下放在已准备好的盖玻片上，立即查看并调整使盖片嵌入载片的凹槽中。然后继续下 1 张。 结果判定 荧光显微镜下观察 1．细胞核发黄绿色荧光为阳性染色细胞，不发荧光为阴性。抗原片中出现阳性染 色细胞为ANA 阳性，否则为阴性。阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。2．根据细胞核着染色荧光的图像，可区分为： ①均质型：细胞核呈均匀一致的荧光； ②周边型(核膜型)：细胞核周围呈现荧光；③斑点型(颗粒型)：细胞核内呈现斑点状荧光； ④核仁型：核仁部分呈现荧光。 . ⑤混合型：两种以上核染色； ⑥应用细胞片做抗原片可检出着点型(ACA) 注意事项 PBS-Tween 缓冲液在 4℃下可存放两周。 根据每次实验的标本量决定需要稀释的FITC 标记的抗人球蛋白的量，稀释后可在 4℃下可存放 1 周。 血清或FITC 标记的抗人Ig 应滴加至加样板上，不能直接滴到载片上。 载片盖到加样板上后，确保反应区与液滴完全接触后，才开始记时温育。 冲洗载片时水流要缓慢，以免冲洗掉基质。载片上的反应区应保持湿润，不要将载片风干。 封片进不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。 封片介质含有荧光稳定剂，应保存在 2-8℃。封好的载片可于 4℃长期保