《小麦土传病毒病病原检测技术规程》.pdfVIP

DB32/T ××××—2022 前 言 本文件按照 GB/T1.1-2020 《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由江苏省作物标准化技术委员会提出并归口。 本文件起草单位：江苏省农业科学院，宁波大学，江苏省植物保护植物检疫站。 本文件主要起草人：周彤、羊健、杜琳琳、朱凤、周益军。 I DB32/T ××××—2022 小麦土传病毒病病原检测技术规程 1 范围 本文件规定了小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒检测原理、设备和试剂、间接酶联免 疫吸附剂测定、斑点酶联免疫吸附剂测定及RT-PCR测定方法。 本文件适用于小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的检测。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 2.1 小麦黄花叶病Wheat yellow mosaic disease 小麦的一种土传病毒病，自然界中由禾谷多黏菌 （Polymyxagraminis）在土壤中传播， 病原为小麦黄花叶病毒 （wheatyellowmosaicvirus）。 2.2 中国小麦花叶病Chinese wheat mosaic disease 小麦的一种土传病毒病，自然界中由禾谷多黏菌 （Polymyxagraminis）在土壤中传播， 病原为中国小麦花叶病毒 （chinesewheatmosaicvirus）。 3 缩略词 小麦黄花叶病毒 wheatyellow mosaicvirus,WYMV 中国小麦花叶病毒 Chinesewheatmosaicvirus,CWMV 酶联免疫吸附剂测定 enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA 间接酶联免疫吸附剂测定 indirect enzyme-linkedimmunosorbent assay，间接ELISA 斑点酶联免疫吸附剂测定 dot enzyme-linked immunosorbent assay，Dot-ELISA 聚合酶链式反应 PolymeraseChain Reaction，PCR 逆转录-聚合酶链式扩增反应 Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction，RT-PCR 4 原理 4.1 间接ELISA原理 ELISA的基本原理：将酶分子与抗体共价结合，得到同时具有免疫活性和酶的生物活性 的酶标抗体。检测时，将已知的抗体吸附在固相载体表面，若受检样本中含有相应的抗原， 则会与固相载体上的抗体发生特异性结合从而随之固定在固相载体上，然后洗涤除去未结合 及多余的其他蛋白，再加入酶标抗体，使其与吸附在固相载体上的抗原特异性结合，最后加 入酶反应底物，底物被酶催化出现颜色反应产生有色产物。因此，可通过底物的颜色反应来 判定有无相应的免疫反应。颜色反应的深浅与受检样品中抗原的量呈正比，故可根据颜色反 应的深浅进行定性或定量分析。 1 DB32/T ××××—2022 间接ELISA，首先将受检样品包被固相载体，经洗涤，加入特定的抗体，若受检样品中 含有相应的抗原，则会形成待测抗原-抗体复合物，再经洗涤后，加入酶标抗体，以形成抗 原-抗体-酶标抗体复合物，然后加入酶反应的底物，通过测定颜色反应的深浅，定性或定量 分析受检样品中的抗原量。 4.2 Dot-ELISA原理 硝酸纤维素膜具有很强的静电吸附力，在中性条件下可有效地吸附蛋白质等生物大分 子，并保持其免疫活性。将抗原吸附在硝酸纤维素膜表面，利用膜作为固相载体进行抗原抗 体反应，通过与相应的抗体和酶标抗抗体的一